Toluen sulfonyl chloride (tosyl chloride) và 3,3,3-trifluoroethanesulfonyl chloride (tresyl chloride) là những tác nhân đơn chức năng mà phản ứng với matrix chứa nhóm hydroxyl như agarose. Những tác nhân này không tạo thêm spacer nào cho matrix. Sự hoạt hoá matrix được tiến hành trong acetone khô để ngăn chặn sự thuỷ phân tosyl chloride/ tresyl chloride. Gel hoạt hoá sau đó được sử dụng để liên kết với ligand trong cả dung môi hữu cơ lẫn dung môi ưa nuớc. Các ligand được cố định trên gel đuợc tosyl hoá ở pH cao (9-10.5), trong khi liên kết của ligand với gel đựơc tresyl hoá thì thực hiện được ở pH trung hoà.
Phản ứng:
Cả tosyl chloride và tresyl chloride đều phản ứng với nhóm hydrosyl của matrix (hình 10). Nhóm amine cơ bản trong ligand sau đó có thể phản ứng với matrix đã hoạt hoá, tạo ra một liên kết amine thứ hai rất ổn định.
Ligand cố định ổn định hơn isourea được tạo ra bằng cyanogen-bromide.
Nhược điểm:
Ở pH trung hoà, liên kết amine thứ hai tích điện duơng.
Quy trình thực hiện: Tác nhân:
1. Tosyl chloride/ tresyl chloride (Aldrich) 2. Pyridine
Hình 10: Hoạt hóa matrix bằng Tosyl/ Tresyl Chloride Sự hoạt hoá:
Sự hoạt hoá nên đưụơc tiến hành trong thiết bị kín có van thông hơi tốt.
1. Sử dụng phễu thuỷ tinh gắn với thiết bị chân không, trao đổi liên tục 100 ml Sepharose 4B (được trương nở trong nước trước) trong acetone khô với mỗi 40 ml hỗn hợp acetone/nuớc (tỷ lệ 30/70 v/v). Tiếp theo trao đổi với hỗn hợp có tỷ lệ 60/40, 80/20, và cuối cùng là với acetone khô tinh khiết (3 lần).
2. Rửa gel trong 100ml acetone khô có chứa 6g tosyl chloride, tạo huyền phù acetone.
(Chú ý: để hoạt hoá bằng tresyl chloride, tiến hành nhỏ giọt 1ml tresyl chloride vào 100 ml huyền phù gel trong acetone khô trong khoảng thời gian 1 phút)
3. Thêm 10 ml pyridine khô để trung hoà HCl tự do và tiếp tục khuấy ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ (10 phút cho sự hoạt hoá tresyl chloride), sử dụng cánh khuấy overhead paddle).
(Chú ý: không sử dụng cánh khuấy từ để tránh làm vỡ hạt gel)
4. Rửa gel hoạt hoá bằng 1l acetone (2 lần), sau đó rửa với 1 mM hỗn hợp HCl/acetone với tỷ lệ lần lựot 30/70, 50/50, 70/30. Cuối cùng rửa gel với 1 mM HCl.
Cố định ligand:
5. Tạo huyền phù gel đã được hoạt hoá với tosyl (100ml) trong 100ml sodiumcarbonate 0.25M, pH 9.5 (gel hoạt hoá bằng tresyl trong sodiumphosphate 0.2M, pH 7.5) chứa 5-10 mg/ml protein. Để phản ứng liên
kết tiếp tục ở 4oC trong 24 giờ và khuấy liên tục bằng cánh khuấy overhead paddle.
6. Rửa gel đã liên kết bừng dung dịch đệm liên kết để loại bỏ những ligand không phản ứng.
7. Khoá những nhóm hoạt hoá thừa của gel bằng cách tạo huyền phù gel trong 100ml ethanolamine 1M, pH 9 trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng.
8. Rửa gel với lượng dư NaCl 1M và nước.