Kỹ thuật này có thể sử dụng đầu dò với đoạn rARN đích do vậy có tính chính xác và độ nhạy cao. Đây là kĩ thuật cho phép phát hiện sự có mặt của nhiều loài vi sinh vật một lúc với thời gian nhanh. Tuy nhiên kỹ thuật cũng phức tạp và phải tốn công thiết kế các mẫu dò và sử dụng vật liệu phóng xạ.
3.2.5 Kỹ thuật PCR:
Kĩ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) do Kary Mullis (Nobel
1993) phát minh, là một kỹ thuật hiện phổ biến trong sinh học phân tử, dựa trên phản ứng khuyếch đại gene. Trong đó môt đoạn DNA được nhân lên rất nhiều lần một cách nhân tạo bởi enzyme DNA Polymerase mà không cần sử dụng vi sinh vật sống.
Trong tự nhiên, enzyme DNA Polymerase có trong nội bào sinh vật chuyên thực hiện chức năng xúc tác cho các phân ứng nhân đôi sợi DNA theo nguyên tắc bổ sung. Phản ứng này xảy ra trong giai đoạn phân chia tế bào.
Tuy nhiên quá trình này cũng có khả năng thực hiện ở trong điều kiện ống nghiệm (Invitro). Ở đó, sợi DNA cũng được tách đôi thành hai sợi đơn bởi nhiệt độ cao (95oC). Với xúc tác Enzyme DNA Polymerase, mỗi sợi DNA đơn được bổ sung thêm tạo sợi kép. Tuy nhiên vơí nhiệt độ cao như thế này thì E rất dễ bị phân hủy và mất đi hoạt tính.
Hiện nay, người ta đã tìm ra được những loại E chịu nhiệt độ rất cao, được tách từ loài vi khuẩn chịu nhiệt (Thermophilic) như vi
khuẩn Thermus aquaticus, những E này gọi là Tag, Flu. Nhiệt độ
110oC Tag và Flu vẫn không bị biến tính.
Về cơ bản, để thực hiện được kĩ thuật PCR cần một số các phần sau :
• Đoạn DNA mẫu (Template) chứa đoạn DNA cần khuếch đại
• Đoạn mồi (Primer) xác định điểm bắt đầu và điểm kết thúc
• Enzyme DNA Polymerase nhân đôi đoạn DNA
• Nucleotide là nguyên liệu cho phản ứng nhân đôi DNA
• Dung dịch đệm
Ngoài ra, do PCR thực hiện trong chu trình nhiệt (khoảng 20-30 lần) nên cần có máy đun nóng và làm nguội môi trường phản ứng trong các ống nghiệm. Thiết bị điện di cần thiết để xác định kích thước DNA ( thực tế là trọng lượng đoạn DNA đã được khuếch đại)
Hình 2.1 : Maùy PCR Nguyên lý của sự khuyếch đại PCR có thể tóm tắt như sau:
Một chu trình phản ứng gồm 3 bước, trong máy PCR tổng số chu trình lặp lại là 30 lần với thời gian rất nhanh.
• Bước 1 : Duỗi xoắn DNA ở nhiệt độ 94oC trong thời gian 1 phút. Chuỗi DNA kép được tháo xoắn tạo 2 sợi đơn.
• Bước 2 : Gắn mồi ở 54oC trong khoảng 45 giây. Primer sẽ bắt dính trên đoạn DNA đơn cần nhân đôi một cách đặc hiệu
• Bước 3 : Kéo dài ở 72oC trong 2 phút. Enzyme sẽ xúc tác phản ứng kéo dài mạch DNA bổ sung cho tới khi gặp điểm kết thúc.
Hình 2.2 : Sơ đồ sao chép DNA