c. Môi trường sống
3.4.1.9. Khuếch đại đoạn gen amoA
DNA tinh sạch được sử dụng làm khuôn mẫu để khuếch đại PCR. Sử dụng đoạn mồi cụ thể cho các operon AMO. Khuếch đại lần 1, cặp mồi 305F và 308R được sử dụng để khuếch đại đoạn gen khoảng 1,5 kb. Đoạn gen được khuếch đại được sử dụng làm khuôm mẫu cho khuếch đại lần 2, với gen amoA thì đoạn mồi sử dụng (amoAF1 và amoARevino) để khuếch đại đoạn gen khoảng 491bp .
Dung dịch phản ứng được chuẩn bị sẳn (50 μl) : đệm PCR (50 mM Tris- HCl, 100 mM NaCl, 1% Triton X-100 [pH 8]), 2,5 mM MgCl2, 200 μM
SVTH : Nguyễn Ngọc Thanh Vân GVHD : TS. Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh KS. Phạm Minh Nhựt
deoxyribonuxleotide triphosphate (dATP, dCTP, dTTP), 0,5 μM mồi, chất phụ PCR (200 mM betain, BSA 1%, 3% DMSO), 10 – 20 ng mẫu DNA và Taq polymerase DNA (2,5U).
Chu trình PCR : biến tính ở 94oC trong 5 phút, 25 chu kỳ (94oC trong 1 phút, 55oC trong 1 phút, 72oC) và kéo dài 72oC trong 7 phút cho lần khuếch đại lần 1. Khuếch đại lần 2 amoA : biến tính ở 94oC trong 3 phút, 35 chu kỳ (94oC trong 30s, 57oC trong 30s, 72oC trong 1,2 phút) và kéo dài ở 72oC trong 5 phút.
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5% (wt/vol) trong đệm TBE 0,5X với DNA được cắt bằng enzyme giới hạn Pst như là phân tử đánh dấu. Gel được nhuộm với ethidium brommide (0,5 μg/ml)và xem kết quả bằng tia UV.
3.4.2. Kết quả
3.4.2.1.Đo nồng độ ammonia
Việc xác định nồng độ amoni trong mỗi mẫu đất thực hiệp theo phương pháp được mô tả bởi Kandeler và Gerber (1988).
So sánh nồng độ amoni ở các mẫu đất khác nhau cho thấy nồng độ ammonia cao nhất là trong đất không có trồng thực vật, nồng độ ammonia thấp nhất là trong các mẫu đất có thực vật họ Proteaceae (hình 3.11). Kết quả này cho thấy thực vật thuộc họ Proteaceae cạnh tranh sử dụng amonia với vi khuẩn oxy hóa amonia.
SVTH : Nguyễn Ngọc Thanh Vân GVHD : TS. Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh
Hình 3.11 : Giá trị nồng độ ammonia từ các mẫu đất có rễ họ Proteaceae.
LX (Ld.xanthoconus), LT (Ls.truncatulum)
LM (Ld.microcephalum), N (mẫu đất không có thực vật)