Cho chế phẩm vào 100 ml môi trường lỏng casein đậu tương, ủ ở 35 - 370C, kiểm tra vi khuẩn mọc ở môi trường. Nếu thấy mọc, dùng que cấy lấy môi trường, cấy lên đĩa thạch Vogel - Johnson (hoặc thạch Baird - Parker hoặc thạch manitol - muối) và môi trường thạch cetrimid. Đậy đĩa, lật ngược hộp Petri, mang ủ. Sau khi ủ kiểm tra nếu không thấy có những khuẩn lạc với đặc tính như ghi trong bảng 2 và bảng 3 (nêu ở phần sau) đối với từng môi trường đã sử dụng thì chế phẩm không có Staphylococcus aureus và
Pseudomonas aeruginosa. Nếu thấy có khuẩn lạc nghi ngờ thì tiếp tục làm các phản ứng
40
*Phản ứng coagulase (đối với Staphylococcus aureus):
Dùng que cấy chuyển khuẩn lạc nghi ngờ đặc trưng từ mặt thạch Vogel-Johnson (hoặc thạch Baird - Parket, hoặc thạch manitol - muối) thêm vào từng ống nghiệm, mỗi ống 0,5 ml huyết tương thỏ hoặc ngựa. Đem ủ 37oC, kiểm tra các ống sau 3 giờ ủ rồi tiếp tục ủ thêm 24h. Nếu thấy có đông huyết tương (ở bất kỳ mức độ nào), chế phẩm có
Staphylococcus aureus.
Bảng 2: Đặc điểm hình thái của Staphylococcus aureus trên các môi trường lựa chọn
Môi trường Thạch Vogel - Johnson Thạch manitol - muối Thạch Baird - Parker Đặc điểm hình thái khuẩn lạc
Màu đen được bao bọc bằng một vùng vàng Khuẩn lạc màu vàng cùng với một vùng vàng xung quanh
Khuẩn lạc màu đen bóng, viền quanh bằng một vùng sáng rõ 2 - 5 mm
*Phản ứng oxydase và sinh sắc tố ( đối với Pseudomonas aeruginosa):
Lấy những khuẩn lạc nghi ngờ đặc trưng từ mặt môi trường thạch cetrimid cấy ria trên mặt môi trường thạch Pseudomonas phát hiện Fluorescin và môi trường Pseudomonas phát hiện Pyocyanin trong hộp Petri. Nếu nhiều khuẩn lạc cần được cấy truyền, có thể chia bề mặt hộp thành bốn phần, mỗi phần cấy một loại khuẩn lạc lựa chọn. Đậy và lật ngược hộp môi trường đã cấy truyền và ủ ở 35 + 2oC ít nhất 3 ngày kiểm tra đường cấy dưới ánh sáng đèn tử ngoại. Kiểm tra các đĩa để xác định có khuẩn lạc đặc trưng theo bảng 3 hay không. Xác nhận bất kỳ khuẩn lạc nghi ngờ nào mọc trên một hoặc nhiều môi trường. Phát hiện Pseudomonas aeruginosa bằng phản ứng oxydase: Nhỏ ngay lên
khuẩn lạc hoặc chuyển khuẩn lạc lên một mẩu (hoặc một khoanh) giấy đã tẩm trước N - dimethyl - phenylen diamin dihydroclorid. Nếu thấy hiện màu đỏ hồng chuyển sang màu tím, chế phẩm có Pseudomonas aeruginosa. Có thể xác định Pseudomonas aeruginosa bằng các phép thử sinh hoá và nuôi cấy thích hợp khác.
Bảng 3. Đặc điểm hình thái của Pseudomonas aeruginosa trên các môi trường lựa chọn
Môi trường Thạch cetrimid
Thạch Pseudomonas để
Thạch Pseudomonas để
41
phát hiện Fluorescin phát hiện Pyocyanin Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Màu lục nhạt thông thường Không màu đến màu vàng nhạt Màu vàng nhạt Huỳnh quang ở ánh sáng tia cực tím
Màu lục Màu hơi vàng Màu xanh nước biển
Phản ứng oxydase Dương tính Dương tính Dương tính Nhuộm Gram Trực khuẩn
Gram âm
Trực khuẩn Gram âm
Trực khuẩn Gram âm