2.9.1.1. Cơ sở khoa học của kĩ thuật huyết thanh học
Cơ sở khoa học của phương pháp này chủ yếu dựa vào hoạt động hệ miễn dịch ở động vật: khi có protein lạ (kháng nguyên) xâm nhập vào máu của cơ thể động vật, hệ thống bạch huyết sẽ sinh ra protein đặc hiệu (kháng thể) để chống lại protein lạ trên. Phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể sẽ tạo kết tủa. Đây là phản ứng tự vệ của động vật, làm cho kháng nguyên gây bệnh bất hoạt và cơ thể động vật được bảo vệ.
2.9.1.2. Phƣơng pháp ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
Nguyên tắc phương pháp dựa trên khả năng gắn kết giữa kháng nguyên và kháng thể. Kháng thể nhận biết protein của virus quan tâm (thường là protein vỏ) được tạo ra trong cơ thể động vật. Sử dụng kháng thể phủ lên đĩa kiểm tra sau đó cho mẫu cần kiểm tra vào giếng (nhựa cây hay mẫu bệnh phẩm đã được ly trích). Nếu virus quan tâm có trong mẫu kiểm tra, kháng nguyên của viurs sẽ gắn vào kháng thể cố định. Bất kì thành phần không gắn kết nào sẽ bị loại bỏ khi rửa giếng, trước khi kháng thể thứ hai nhận biết kháng thể thứ nhất được thêm vào. Kháng thể thứ hai cho phép phát hiện virus gián tiếp nhờ phân tử tín hiệu (reporter molecule), thường là do một enzyme tác động lên cơ chất đổi màu. Sự đổi màu cơ chất được đánh giá bằng quang phổ. Với sự hiệu chỉnh hợp lí, ELISA có thể định tính cũng như định lượng.
Phương pháp này có thể được sử dụng để kiểm tra một loại virus trên nhiều cây, mỗi giếng một mẫu cây. Có thể kiểm tra đồng thời nhiều virus trong 1 đĩa đơn với các kháng thể khác nhau phủ ở mỗi giếng với 2 hoặc 3 lần lặp lại.
Ưu điểm: độ chính xác cao, đơn giản và giá thành thấp.
Hạn chế : đòi hỏi huyết thanh kháng thể đơn dòng hay đa dòng đặc hiệu với virus và không phản ứng chéo protein thực vật.
Một hình thức khác của ELISA gọi là Thí nghiệm đo điện thế miễn dịch enzyme (Voltametric enzyme immunoassay). Phương pháp nhằm mục đích phát hiện sự thay đổi độ dẫn điện của cơ chất khi enzyme gắn vào kháng thể thứ hai. Phương pháp này nhạy hơn ELISA, được sử dụng để phát hiện virus khảm dưa leo (Cucumber mosaic virus).
2.9.1.3. Phƣơng pháp TBIA (Tissue blot immunoassay)
Giống ELISA, phương pháp này sử dụng kháng thể kháng virus. Nhựa từ mô thực vật được chuyển lên giấy thấm, màng nylon hay nitrocellulose và virus được phát hiện nhờ các probe đã đánh dấu thường là các chất phát quang. Quá trình này ít thao tác hơn so với ELISA, nhanh hơn, nhạy hơn, đơn giản (không đòi hỏi tách chiết virus) và rẻ tiền hơn (cần rất ít thiết bị), thích hợp khi cần kiểm tra 1000 – 2000 mẫu mỗi ngày.
Bên cạnh các kĩ thuật hiện đại, các phương pháp quan sát phản ứng huyết thanh như: quan sát kết tủa của phản ứng dưới kính hiển vi có tụ quang đen, phản ứng khuếch tán gel…[2] cũng được sử dụng để chẩn đoán virus.
2.9.2. Phƣơng pháp hiển vi quang học và vi điện tử 2.9.2.1. Quan sát bằng kính hiển vi quang học [2] 2.9.2.1. Quan sát bằng kính hiển vi quang học [2]
Trong quá trình kí sinh, virus thực vật thường có khả năng tạo dạng kết tinh vô định hình hoặc dạng đặc trưng do vô số cá thể virus kết hợp lại với nhau. Virus khảm thuốc lá thường tạo dạng kết tinh trong suốt ở mô tế bào cây bệnh. Tinh thể virus có thể nhuộm màu và quan sát được trên kính hiển vi quang học thông thường ở độ phóng đại 80 lần.
2.9.2.2. Quan sát bằng kính hiển vi điện tử
Nhờ kính hiển vi điện tử, sợi virus hay hạt virus có thể được quan sát chính xác hình thái và cấu tạo. Hình thái virus có thể được mô tả một cách chính xác ở độ phóng
đại hàng vạn lần. Ngày nay, kính hiển vi điện tử tia xuyên được sử dụng như một công cụ rất tích cực để tìm hiểu hình thái và cấu tạo của virus thực vật.
2.9.3. Phƣơng pháp chẩn đoán sinh học phân tử
2.9.3.1. Cơ sở khoa học của các phƣơng pháp chẩn đoán sinh học phân tử
Các kĩ thuật sinh học phân tử dựa trên vật chất di truyền của virus (RNA/DNA) và quá trình tái tổ hợp của chúng.
Khi xâm nhập vào tế bào kí chủ, RNA virus được phóng thích khỏi lớp vỏ protein. Các enzyme cảm ứng tổng hợp RNA (RNA replicase, RNA synthetase) cùng với RNA virus (sợi +) đóng vai trò là sợi khuôn mẫu giúp cho sự tổng hợp RNA virus (sợi - và sợi +). Với các loại virus có RNA (sợi -) thì chúng buộc phải chuyển sang dạng mRNA (sợi +). Khi xâm nhiễm vào tế bào kí chủ, virus đã đưa RNA (sợi -) và enzyme vào tế bào. Các virus có RNA sợi kép thì quá trình hình thành RNA (sợi – và sợi +) được thực hiện nhờ RNA polymerase. Với các virus chứa DNA thì sự tổng hợp vật chất di truyền được sự trợ giúp của enzyme từ tế bào kí chủ.
2.9.3.2. Polymerase chain reaction (PCR) và Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) chain reaction (RT-PCR)
PCR và RT-PCR là các kĩ thuật phổ biến để phát hiện và xác định RNA và DNA của virus thực vật. Phương pháp này cực kì nhạy, không quá đắt tiền và đòi hỏi ít kĩ năng thực hiện. Trong trường hợp RNA virus, một sợi cDNA bổ sung với RNA virus được tổng hợp với xúc tác reverse transcriptase (RT). Các primer được kéo dài bởi DNA polymerase bền nhiệt trong một chuỗi các bước biến tính và kéo dài, làm tăng DNA mục tiêu theo cấp số nhân. Hiện nay có 3 loại primer cơ bản được sử dụng để khuếch đại RNA virus (xem Phụ lục 3)[12]. Đối với DNA virus thì bước RT không cần thiết.
Có nhiều dạng khác nhau phát triển trên kĩ thuật cơ bản nhằm tăng độ nhạy, thay đổi tính đặc hiệu hay cho phép tự động phát hiện. Các dạng thường gặp: Multiplex RT-PCR, Fluorescence RT-PCR using TaqmanTM technology, Competitive flourescence PCR (CF-PCR), Immunocapture PCR (IC-PCR), Nested PCR.
2.9.3.3. Phƣơng pháp sử dụng các đoạn đa dạng về chiều dài hạn chế (Restriction fragment length polymorphism – RFLP) fragment length polymorphism – RFLP)
RFLP được sử dụng kết hợp với PCR để xác định sự khác nhau giữa các virus dựa trên sự hiện diện của các vị trí nhận biết của enzyme cắt giới hạn. Sau khi khuếch
đại PCR, các mẫu được phân cắt bởi enzym cắt giới hạn và các kích thước của đoạn phân cắt được phân tích bằng điện di.
RFLP là một phương pháp phân biệt các dòng virus không cần thực hiện cloning và sequencing. Hiệu của quả phương pháp này phụ thuộc vào sự đa hình trong phạm vi vị trí nhận biết của enzyme cắt giới hạn.
2.9.3.4. Probe đánh dấu (Labelled probes)
Việc lai probe DNA hay RNA giúp cho việc phát hiện nucleic acid virus ở cả hai dạng, sợi đơn và sợi đôi. cDNA probe có thể được gắn nhãn với các isotope hay probe không có chất phóng xạ. cDNA probe thường được sử dụng để phát hiện RNA virus vì dạng lai giữa RNA/RNA bền vững hơn dạng lai DNA/RNA. Dịch ly trích RNA từ mô nhiễm được chuyển lên màng, cho lai với probe và phát hiện RNA virus.
2.10. Các nghiên cứu về bệnh héo đỏ đầu lá (bệnh wilt) 2.10.1. Các nghiên cứu ngoài nƣớc 2.10.1. Các nghiên cứu ngoài nƣớc
Bệnh wilt lần đầu tiên được mô tả bởi các nhà khoa học thuộc phòng thí nghiệm Hiệp hội những người trồng mía Hawaii (HSPA) năm 1910. Năm 1900 bệnh này gây thiệt hại nặng nề cho công nghiệp trồng dứa ở Hawaii; cho đến nay bệnh xuất hiện ở hầu hết các khu vực trồng dứa trên thế giới [11,13].
Sự liên hệ giữa bệnh wilt-rệp-kiến
Những nghiên cứu bước đầu về bệnh wilt trên cây dứa bắt đầu từ mối liên hệ giữa bệnh wilt-rệp sáp-kiến được thực hiện bởi Kenneth G. Rohrbach và cộng sự (1988). Ở cây bệnh wilt luôn có sự hiện diện của rệp sáp và kiến. Không có kiến quần thể rệp sáp không thể gia tăng số lượng (Rohrbach và c.s., 1988). Sự có mặt của kiến cho phép 2 loài rệp sáp Dysmicoccus brevipes (Cockerell) và D. neobrevipes
Beardsley phát triển. Kiến bảo vệ rệp sáp tránh các loài kí sinh và các loài tấn công rệp đồng thời kiến tiêu thụ chất “mật” do rệp tiết ra giúp cho quá trình xâm nhập của rệp diễn ra thuận lợi.
Nguyên nhân gây bệnh
Năm 1989, các tiểu phần tương tự closterovirus được tinh sạch từ mô dứa Hawaii bệnh và phân loại. Đến năm 1997, các virion tương tự closterovirus (PCV) liên quan về mặt huyết thanh với quần thể PCV Hawaii được tinh sạch từ cây dứa bệnh ở Australia. Kháng thể đơn dòng (Mab) đặc hiệu closterovirus dứa được sử dụng trong thử nghiệm miễn dịch mô (TBIA) để phát hiện PCV ở dứa.
Hu và c.s. (1997) đã thực hiện nghiên cứu kiểm tra sự hiện diện của PCV trên hơn 20.000 mẫu dứa bằng phương pháp TBIA. PCV được phát hiện trên những cây dứa không thể hiện triệu chứng bệnh. Phân tích các kiểu bệnh PMW ở Sri Lanka được G. Hughes và S. Samita (1997) [10] thực hiện tìm ra sự tương quan giữa triệu chứng và các yếu tố lây nhiễm. Các kết quả này góp phần quan trọng cho lời giải đáp nguyên nhân gây bệnh héo lá liên quan đến rệp sáp. Nguyên nhân gây bệnh là virus PMWaV, được xếp vào họ Closteroviridae dựa vào đặc tính lây truyền.
Yếu tố lây truyền virus
Sether và c.s. (1998) thực hiện thí nghiệm về sự lây truyền virus của 2 loài rệp sáp Dysmicoccus spp. thông qua tỉ lệ giữa cây nhiễm virus (-) và cây không nhiễm virus (+) trước và sau khi tiếp xúc với rệp trong trường hợp có kiến và không có kiến. Tình trạng PMWaV của cây thí nghiệm được xác định bằng phương pháp TBIA và ISEM (immunosorbent electron microscopy).
Thí nghiệm sự lan truyền virus của D. brevipes khi không có kiến
Nghiệm thức 1(NT1): cây (-) trồng xen kẽ cây (+), không chủng rệp. NT 2: cây (-) được chủng rệp không mang virus.
NT 3: cây (-) trồng xen kẽ cây (+) được chủng rệp mang virus.
Kết quả ở nghiệm thức 1 và 2 tỉ lệ cây ban đầu không thay đổi trong khi ở nghiệm thức 3 có sự gia tăng số cây nhiễm virus.
Thí nghiệm sự lan truyền virus bởi D. brevipes khi có kiến NT 1: cây (-) trồng xen kẽ cây (+) và không chủng rệp NT 2: cây (-) được chủng rệp không mang virus
NT 3: cây (-) trồng xen kẽ cây (+) , chủng rệp không mang virus
Kết quả cho thấy ở NT 1 và 2 tỉ lệ cây ban đầu không đổi; ở NT 3 tỉ lệ cây nhiễm virus cao hơn và thời gian lây nhiễm ngắn hơn so với trường hợp không có kiến.
Nghiên cứu trên cho thấy rõ vai trò chính của rệp trong việc lây lan virus và yếu tố thúc đẩy sự lây lan là kiến.
Các phƣơng pháp phát hiện PMWaV
Sether và c.s. (2001) đã sử dụng kĩ thuật RT-PCR và Southern Blot để phát hiện PMWaV. Mô lá hay rệp được nghiền trong nitơ lỏng và tách chiết RNA tổng số sử dụng Rneasy Plant Mini Kits (Qiagen Inc., Chatsworth, CA). Mẫu RNA tinh sạch được bảo quản ở -800C cho đến khi sử dụng. cDNA thứ nhất dựa trên vùng gene mã hóa HSP 70 của PMWaV-1 và PMWaV-2 được tổng hợp từ 2,5 – 7 g RNA sử dụng primer tái tổ hợp 223 và 226 cho PMWaV-1 và PMWaV-2; việc tổng hợp thực hiện ở 420C (45 phút) sau đó bất hoạt ở 950C (5 phút). Sau đó phản ứng PCR được tiếp tục trong cùng tube với primer 224 và 225 với chương trình nhiệt như sau: giai đoạn biến tính 940C (4 phút); 45 chu kì 940C (1 phút), 540C (1 phút), 720C (1 phút) và giai đoạn kéo dài cuối cùng 720C (10 phút). Sản phẩm PCR được quan sát trên gel agarose 1% được nhuộm ethidium bromide.
Gel chứa sản phẩm khuếch đại được làm biến tính, trung hòa và chuyển lên màng Zeta- Probe GT (Biorad, Hercules, CA) thực hiện Southern blot. Kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho PMWaV được sử dụng trong kĩ thật TBIA; Mab 35-6-5 cho PMWaV-1 và Mab 63-2-2 cho PMWaV-2. RT-PCR và TBIA được sử dụng song song để phát hiện PMWaV.
Loại bỏ virus
Theo Sether và c.s. (2001), PMWaV-1 ở chồi dứa nhiễm bệnh được loại bỏ bằng xử lí nhiệt. Quá trình xử lí nhiệt gồm 2 giai đoạn: 350C trong 24 giờ tiếp theo ngay sau đó là 580C trong 40 phút hay 560C trong 60 phút trong bồn nước (water bath). Lá được cắt khỏi chồi 24 giờ sau giai đoạn 2 xử lí nhiệt. Thực hiện vô mẫu với các khối vuông cắt ra từ chồi ngọn và chồi đỉnh có kích thước 1mm . Các môi trường nuôi cấy khác nhau đã được sử dụng để tái sinh mẫu cấy. Khi rễ phát triển, cây tái sinh hoàn chỉnh được chuyển ra trồng ngoài đất. Thực hiện việc kiểm tra PMWaV bằng RT-PCR trước đó. Thử nghiệm TBIA đặc hiệu cho PMWaV được sử dụng 1 – 2 tháng sau khi trồng cây ngoài đất. Kết quả thực hiện cho thấy 92% cây hồi phục ở tất cả các nghiệm thức.
2.10.2. Các nghiên cứu trong nƣớc
Nhìn chung, Việt Nam chưa nghiên cứu nhiều về bệnh đỏ đầu lá. Các đề tài nghiên cứu chỉ dừng lại ở bước xác định mối liên quan mật số rệp và mức độ bệnh ở dứa. Theo kết quả điều tra tình hình bệnh wilt của nhóm điều tra bệnh hại trên dứa
thuộc trường Đại học Nông Lâm Tp. HCM năm 2003 cho thấy bệnh wilt xuất hiện ở tất cả các ruộng với tỉ lệ bệnh cao: nông trường Thọ Vực (Đồng Nai) có tỉ lệ bệnh cao nhất: 12,1%, tiếp theo là nông trường Phạm Văn Hai 6% và nông trường Lê Minh Xuân 7%; còn ở Bến Lức (Long An), Tân Phước (Tiền Giang) và Đức Trọng (Lâm Đồng) tỉ lệ bệnh lần lượt là 9,3%, 8,1% và 4,1% (Phạm Văn Khánh, 2004; Võ Thị Mỹ Hân, 2004; và Võ Thị Thúy Huệ, 2004).
Phòng trừ bệnh
Theo Nguyễn Văn Kế (2000), để phòng chống bệnh wilt cần áp dụng biện pháp phòng trừ tổng hợp như: chọn giống ít nhiễm bệnh để trồng (giống Cayenne rất dễ nhiễm bệnh). Với các giống trong nước thì dứa Kiên Giang ít bệnh hơn dứa Bến Lức. Lưu ý không lấy chồi ở những vườn bị bệnh kết hợp với sử dụng thuốc trừ sâu để xử lí chồi trước khi trồng. Khử đất để trừ kiến và rệp. Làm sạch cỏ và các cây dứa của mùa trước còn sót lại để hạn chế chỗ ẩn nấp của rệp và kiến.
PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Nội dung
Đề tài thực hiện gồm 2 nội dung như sau:
Nội dung 1: Tạo cây dứa Cayenne sạch virus bằng nuôi cấy ĐST và xử lí nhiệt. Nội dung 2: Kiểm tra PMWaV-1 và PMWaV-2 trên cây dứa in vitro nuôi cấy từ ĐST đã qua xử lí nhiệt bằng kĩ thuật RT-PCR.
3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ 1/3 – 30/8/2005 tại Bộ môn Công Nghệ Sinh Học và Trung tâm phân tích thí nghiệm Đại học Nông Lâm Tp. HCM.
3.3. Nội dung 1: Tạo cây dứa Cayenne in vitro sạch virus bằng cách kết hợp xử lí nhiệt và nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng
Thí nghiệm tiến hành trên chồi dứa Cayenne in vitro có nguồn gốc khác nhau: Trung Quốc, Thái Lan và Lâm Đồng. Cây dứa in vitro cao từ 4 – 5 cm được xử lí nhiệt trong thời gian 30 ngày. Sau đó tiến hành tách ĐST các cây đã xử lí nhiệt để nuôi cấy. Chồi dứa tái sinh từ đỉnh sinh trưởng sau 70 ngày nuôi cấy được kiểm tra virus PMWaV bằng RT-PCR để đảm bảo là cây sạch virus.
3.3.1. Vật liệu
3.3.1.1 Mẫu nuôi cấy
Sử dụng chồi dứa Cayenne bị bệnh wilt gồm 3 giống như sau:
Giống 1: giống Trung Quốc do Nông trường Thọ Vực, Đồng Nai cung cấp. Giống 2: giống Thái Lan do Nông trường Phạm Văn Hai, Tp HCM cung cấp.
Giống 3: giống Lâm Đồng do Chi cục BVTV Đơn Dương, Lâm Đồng cung cấp.
3.3.1.2. Thiết bị và dụng cụ
Các thiết bị phục vụ nuôi cấy mô như Autoclave, tủ cấy vô trùng, đèn UV, dụng cụ nuôicấy mô…
Bình nuôi cấy 500ml, ống nghiệm 2,5x 10 cm
Tủ xử lí nhiệt Environmental Test Chamber MLR-350 Kính hiển vi soi nổi Olympus SZ40
3.3.1.3. Hóa chất
Môi trường nuôi cấy cơ bản MS (Murashige & Skoog, 1962) Chất điều hòa tăng trưởng N6-benzyladenine [BA] (2mg/l)
3.3.1.4. Phƣơng pháp tiến hành Tạo nguyên liệu ban đầu Tạo nguyên liệu ban đầu
Dùng môi trường khoáng cơ bản MS bổ sung BA (2mg/l) để nhân chồi 3 giống dứa Cayenne Trung Quốc, Thái Lan và Lâm Đồng. Sử dụng bình nuôi cấy 500ml, mỗi bình chứa 50 ml môi trường được hấp tiệt trùng bằng Autoclave ở điều kiện 1210C, 1,2 atm trong 25 phút trước khi sử dụng. Sau 1 tháng, tách chồi và cấy chuyền trong tủ cấy vô trùng.
Các bình nuôi cấy được bảo quản trong phòng tăng trưởng ở điều kiện như sau: Nhiệt độ: 24 + 20C
Thời gian chiếu sáng: 16 giờ ( từ 6 giờ – 21 giờ) Cường độ ánh sáng: 1000 – 2000 lux
Ẩm độ: 55% – 60%
Xử lí nhiệt
Cây dứa in vitro cao khoảng 4 – 5 cm được cấy chuyền sang môi trường MS