Giới thiệu chung [1]
Bệnh hại do virus thực vật gây ra cho nền nông nghiệp rất lớn. Nhƣng xác định đúng tác nhân gây ra những thiệt hại này đối với từng loại cây trồng gặp nhiều khó khăn vì bệnh do virus gây ra thƣờng rất khó xác định, do kích thƣớc của chúng quá bé, do biến chuyển của quá trình gây bệnh thƣờng rất phức tạp và chịu ảnh hƣởng của nhiều điều kiện khác nhau.
Ví dụ: Theo J.S.Hu và cộng sự, bệnh héo do virus (Mealybug wilt of pineapple- MWP) là bệnh gây thiệt hại ở nhiều khu vực trồng dứa trên thế giới. Các nghiên cứu đã chứng minh rằng một yếu tố tiềm tàng liên quan đến bệnh là virus. Một dạng closterovirus hình que gấp khúc đƣợc phân lập từ những cây có triệu chứng MWP ở Hawaii. Tuy nhiên sau đó những tiểu phần closterovirus cũng đƣợc tìm thấy ở cả cây dứa có và không có thể hiện triệu chứng trên phạm vi thế giới. Virus liên quan đến bệnh héo ở dứa (PMWaV) thực chất là phức hợp của 2 loại virus PMWaV-1 và PMWaV-2. Vì tác nhân không biểu hiện ra ngoài không gây ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của dứa, để phát hiện phân biệt hai tác nhân này ở những cây không và có biểu hiện ra ngoài là rất khó khăn.
STT Tổ chức Tên cơ sở dữ liệu Địa chỉ trang web 3 SIB (http://au.exp asy.org) SWISS-PROT http://au.expasy.org/sprot/ SWISS-2DPAGE http://au.expasy.org/ch2d/ PROSITE http://au.expasy.org/prosite/ ENZYME http://au.expasy.org/enzyme/ SWISS-3DIMAGE http://au.expasy.org/sw3d/ CD40L http://au.expasy.org/cd40lbase/ 4 CIB/DDBJ DDBJ http://www.ddbj.nig.ac.jp 5 Pdbj Pdbj http://www.pdbj.org 6 PDB PDB http://www.pdb.org 7 wwPDB wwPDB http://www.wwpdb.org
Trong đó:
ORF I Movement protein ORF II Insect transmission factor ORF III
ORF IV Capsid protein
ORF V Protease, reverse transcriptase and RNaseH ORF VI Translational activator / Inclusion body protein ORF VII Unknown (dispensable)
Hình 2.6 Tổ chức genome của virus CaMV (Caulimoflower mosaic virus)
2.4.1. CAULOMOVIRIDAE [29]
2.4.1.1. Khái quát
Caulimoviriruse là họ virus thực vật có genome chứa dsDNA. Đƣợc chia ra làm năm nhóm gồm:
Caulimovirus (loài đặc trƣng: cauliflower mosaic virus).
Soymovirus (loài đặc trƣng: Soybean chlorotic mottle-like viruses). Cavemovirus (loài đặc trƣng: Cassava vein mosaic-like viruses). Tungrovirus (loài đặc trƣng: Rice tungro bacilliform-like viruses). Badnavirus (loài đặc trƣng: Cammelina yellow mottle virus). Petuvirus (loài đặc trƣng: Petunia vein clearing-like virus).
Trong đó, Virion của các loài Caulimovirus, Soymovirus, Cavemovirus, Petuvirus có đƣờng kính khoảng 50 nm. Còn Tungrovirus và Badnavirus có chiều dài 110-400 và 130 nm, đƣờng kính khoảng 30-35 và 30-35 nm tƣơng ứng. Các loài trong họ có kích thƣớc genome khoảng 7,5-8 kb và tổ chức genome gồm 9 ORF (Open Reading Frame) trong ORF1 gồm có ORF1a và ORF1b). Sự sao mã genome của virus trong tế bào ký chủ phụ thuộc vào gene reverse transcriptase (gene này không chèn vào DNA của tế bào ký chủ trong quá sao mã và dịch mã)
2.4.1.2. Cấu tạo
Virion có cấu trúc đơn giản gồm một lớp vỏ capsid. Viron không có áo (enveloped) bao bọc bên ngoài. Capsid có hình cầu hoặc dạng bacilliform. Ở dạng cầu có đƣờng kính khoảng 35-47.52-50 nm. Các lớp vỏ (shell) capsid của virion là tổ hợp của những màng đa, sự sắp xếp của capsomer không có sự phân biệt. Còn ở dạng bacilliform thì capsid có độ dài 130 nm hoặc 60-900 nm và có đƣờng kính 24-30-35 nm.
2.4.1.3. ĐẶC TÍNH SINH HỌC
Dãy ký chủ tự nhiên
Ký chủ của virus liên quan đến Domain Eucarya. Mối quan hệ vector và ký chủ trung gian
Virus có thể đƣợc vận chuyển bởi một số nhân tố sau: vector, hạt, phấn hoa, sự cọ sát giữa hai ký chủ,…
Vùng phân bố
Phân bố khắp nơi nhƣ châu Phi, Mỹ, Á,…
2.4.1.4. Cơ chế xâm nhiễm và sao mã trong tế bào ký chủ [18]
Virus tấn công vào tế bào ký chủ thông qua các thụ thể trên màng, khi vào tế bào ký chủ tiến hành cởi bỏ lớp vỏ, phóng thích dsDNA vào tế bào chất của tế bào ký chủ. Sợi dsDNA này tiến hành đi vào nhân của tế bào ký chủ, sau đó nó tiến hành nhân bản trong nhân và sao mã tạo mRNA dƣới sự tham gia của các enzyme của nhân và virus (DNA-dependent RNA polymerase). mRNA này từ nhân đi ra tế bào chất của tế bào ký chủ để thực hiện việc dịch mã. Các protein của sự dịch mã mRNA virus lại trở
Hình 2.8 Cơ chế nhân bản, sao mã và dịch mã vào tế bào ký chủ của virus dsDNA
lại nhân, kết hợp với sản phẩm của quá trình nhân bản, để hình thành nên các virion, các virion này thoát khỏi nhân và cuối cùng ly giải ra khỏi tế bào ký chủ (Hình 2.8).
2.4.2. CLOSTEROVIRIDAE
2.4.2.1. Khái quát [12]
Closteroviridae cũng là họ virus gây hại trên thực vật, có bộ genome là ssRNA và virion có hình dạng sợi tròn mảnh (flexuous rod-shaped virion), có độ dài khoảng 1250-2200 nm chứa một sợi sense dƣơng, kích thƣớc của một RNA sợi đơn khoảng 15,5-19.3 kb (Martelli và cộng sự, 2002). Đƣợc chia ra làm 3 nhóm gồm: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ampelovirus (loài đặc trƣng: Grapevine leafroll-associated virus 3). Closterovirus (loài đặc trƣng: Beet yellows virus).
Crinivirus (loài đặc trƣng: Lettuce infectious yellows virus).
2.4.2.2. Cấu tạo [30]
Virion có cấu tạo đơn giản gồm có một lớp vỏ (capsid), không có lớp áo (enveloped) bao bên ngoài. Capsid của nó rất mảnh, có độ dài khoảng 650-900 hoặc 1200-2325 nm và có đƣờng kính khoảng 10-13 nm.
Hình 2.9 Hình thái virion của Citrus tristeza virus thuộc Closterovirus
2.4.2.3. Cơ chế xâm nhiễm và sao mã trong tế bào ký chủ [18]
Thông qua các thụ thể trên màng của tế bào ký chủ, virus nhận biết và tấn công vào vào tế bào ký chủ để đi vào tế bào chất của tế bào ký chủ. Khi ở trong tế bào chất virus tiến hành sự hóa acid thể nhân (acidification of endosome) để tạo ra sợi single strand RNA sense (+). Ở trong tế bào chất, mRNA này có hai nhiệm vụ là:
Thực hiện việc dịch mã ra protein virus, protein này sau đó đƣợc biến đổi để hình thành nên các protein cấu trúc của virus
Sao mã genome của virus tiếp đó tạo nên sợi single strand RNA (ssRNA). Các protein cấu trúc đƣợc hình thành sẽ “gói” các ssRNA ở trên để hình thành các virion trong tế bào chất, sau đó ly giải màng tế bào ký chủ và phóng thích ra ngoài. (hình 2.10).
2.5. Gene Hsp-70 và Reverse transcriptase-RNaseH
Mụch tiêu của khóa luận là xây dựng CSDL phục vụ cho việc phân biệt các loài trong họ hay phân biệt các họ với nhau thông qua phản ứng PCR phát hiện. Nên chúng tôi chỉ quan tâm đến vùng gene bảo tồn để tiến hành xây dựng CSDL. Mặc dù, trong hai họ virus này có nhiều gene bảo tồn, nhƣng sau khi tìm hiểu thông tin chúng tôi tiến hành xây dựng CSDL về hai gene hsp-70 và RT-RnasH với hai lý do sau:
Thứ nhất, gene hsp-70 là gene quan trọng ở Closteroviridae khi tồn tại trong môi trƣờng sốc nhiệt và gene Reverse Transcriptase-RNaseH (RT-RNaseH) ở
Caulimoviridae thuộc nhóm Retrovirus nên gene RT-RNaseH rất quan trọng cho quá trình hoàn thành chu kỳ sống của chúng trong tế bào ký chủ.
Thứ hai, các thông tin về trình tự hai gene này đƣợc nghiên cứu, giải trình tự và đăng tải nhiều trên CSDL nucleotide của NCBI.
2.5.1. Gene Reverse transciptase-RnasH (RT-RNaseH)
2.5.1.1. Vị trí gene RT-RNaseH nằm trong genome [15, 16]
Gene RT-RNaseH đây là tổ hợp của hai gene RT và RNaseH mã hóa cho enzyme reverse transcriptase và ribonuclease H (RNaseH) thuộc ORF5 trong tổ chức genome của Cauliflower mosaic virus. Đây là hai gene có mối quan hệ chặt chẽ trong quá trình thực hiện sao chép từ ssRNA sang dsDNA của quá trình tạo genome hoàn chỉnh của virus. Ngoài ra, trong ORF5 này còn chứa một số gene khác mã hóa cho một số polyprotein khác nhƣ aspartic protease, protein áo,… Còn một số thành viên khác thuộc giống Badnavirus thì gene này nằm trong ORF3. Gene RT-RNaseH bảo tồn trong họ mã hóa cho protein reverse transcriptase-RNaseH, đây là một trong những protein bảo tồn trong họ virus Caulimoviridae.
2.5.1.2. Chức năng của protein [31]
Đối với các loài virus có tổ chức genome là dsDNA trong quá trình sao mã trong tế bào ký chủ, chúng sử dụng enzyme Reverse transcriptase-RNaseH để hoàn thành chu kỳ sao mã của chúng.
Protein Reverse transcriptase-RNaseH có hai chức năng:
DNA polymerase: Trong chu kỳ sống của virus reverse transcriptase chỉ
sao chép RNA. Nó sẽ sao mã cả khuân mẫu RNA và DNA sợi đơn. Trong cả hai trƣờng hợp này nó điều cần những primer RNA hoặc DNA để khởi đầu cho sự tổng hợp của nó.
Hình 2.13 Vị trí gene hsp-70 nằm trong tổ chức genome của Beet yellows virus (BYV)
Hình 2.12 Protein Reverse transcriptase
RNase H: là một ribonuclease, enzyme này có chức năng phân tách RNA
từ những RNA-DNA lai, RNA-DNA lai này đƣợc hình thành trong quá trình sao mã ngƣợc của đoạn khuôn mẫu RNA. RNase H hoạt động có hai tính năng endonuclease và exonuclease trong quá trình phân tách RNA-DNA lai.
2.5.2. Gene hsp-70
2.5.2.1. Vị trí gene hsp-70 nằm trong genome [13, 17]
Gene hsp-70 mã hóa cho enzyme HSP-70 thuộc ORF2 trong tổ chức genome (gồm có 9 ORF nằm trong 2 RNA là RNA1 và RNA2) và gene này thuộc RNA2 của họ Closteroviridae. Đây là gene bảo tồn trong họ và nhiều nghiên cứu tiến hành xây dựng cây phát sinh loài dựa trên gene này.
2.5.2.2. Chức năng [10] (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Protein HSP-70 (hình 2.14), trọng lƣợng phân tử 70 kD đƣợc mã hóa từ gene
hsp-70 có vai trò quan trọng trong quá trình tồn tại của sinh vật trong môi trƣờng có sự thay đổi đột ngột về nhiệt độ. Ngoài ra, protein HSP-70 còn tham gia vào một số quá trình điều hòa quan trọng khác nhƣ: giúp sự hình thành cấu của protein, giúp di chuyển của virus qua các tế bào ký chủ,…Đây là protein bảo tồn trong họ.
PHẦN 3
PHƢƠNG PHÁP VÀ CHƢƠNG TRÌNH SỬ DỤNG 3.1. Các chƣơng trình và ngôn ngữ lập trình đƣợc sử dụng
3.1.1. Hệ điều hành: Windows XP (Microsoft). Xây dựng CSDL trình tự nucleotide, protein ở Caulimoviridae và Closteroviridae trên hệ điều hành này.
3.1.2. Các chƣơng trình phân tích trình tự
3.1.2.1. Chƣơng trình so sánh trình tự ClustalW [26]
ClustalW là một phần mềm (chạy trên nền Dos) dùng để so sánh sự tƣơng đồng của hai hay nhiều trình tự sinh học (pairswise or mutiple alignment). ClustalW mô tả kết quả bằng hệ thống các kí hiệu làm nổi bậc những nét đặc trƣng trong những đoạn tƣơng đồng. ClustalW ngày càng trở nên hữu ích cho các nhà nghiên cứu trong việc tìm kiếm những vùng bảo tồn trên những trình tự DNA hoặc protein. Sự hiểu biết về mutiple alignment giúp ích rất nhiều cho các nhà khoa học trong việc dự đoán cấu trúc bậc hai, bậc ba của protein, đồng thời phát hiện sự tƣơng đồng giữa những đoạn gene (hoặc protein) vừa đƣợc giải trình tự với những gene (hoặc protein) đã tồn tại.
ClustalW tiến hành so sánh tƣơng đồng nhiều trình tự sinh học qua ba giai đoạn: Đầu tiên chƣơng trình sử dụng thuật toán alignment xấp xỉ của Wilbur và Lipman năm 1983 để tính hệ số tƣơng đồng giữa mỗi cặp trình tự.
Những hệ số tƣơng đồng tính đƣợc sẽ đƣợc sử dụng để thành lập cây phả hệ (“Guide tree” hay dendrogram) bằng phƣơng pháp UPGMA (Unwieghted Pair – Group Method) của Sneath và Sokal năm 1973.
Cuối cùng các trình tự đƣợc so sánh với những nhóm trình tự lớn hơn và cứ thế tiếp tục. Ở mỗi giai đoạn so sánh này, ClustalW sẽ sử dụng thuật toán của Myers và Miller (1998) nhằm tối ƣu kết quả.
ClustalW 1.83 đƣợc sử dụng trong khóa luận này, đƣợc tải về từ trang web (http://www.es.embnet.org/Services/ftp/software/ebi/dos/clustalw/)
3.1.2.2. Chƣơng trình tìm kiếm các trình tự tƣơng đồng – BLAST [27] BLAST là một chƣơng trình tìm kiếm và so sánh trình tự tƣơng đồng đƣợc BLAST là một chƣơng trình tìm kiếm và so sánh trình tự tƣơng đồng đƣợc nhiều ngƣời dùng nhất hiện nay. Thuật giải của BLAST xuất phát từ ý tƣởng “liệu trong ngân hàng dữ liệu (bao gồm cả CSDL cục bộ và những CSDL lớn trên thế giới
nhƣ GenBank, EMBL,…) có trình tự nào giống hoặc gần giống với trình tự đang quan tâm”. BLAST thực hiện so sánh trình tự nhập vào (có thể DNA hay protein) với những trình tự trong CSDL. Kết quả của BLAST là những số liệu thống kê chính xác về tỉ lệ tƣơng đồng và nguồn gốc các trình tự.
Chiến lƣợc tìm kiếm trình tự tƣơng đồng trong BLAST đƣợc thực hiện qua ba bƣớc chính:
Đầu tiên BLAST tìm kiếm những đoạn tƣơng đồng HSPs (High Scoring Pair) giữa một trình tự đƣa vào và mỗi trình tự trong CSDL.
Công việc tiếp theo là thực hiện đánh giá ý nghĩa thống kê dựa trên bất cứ sự tƣơng đồng nào đƣợc tìm thấy.
Sau cùng BLAST đƣa ra một báo cáo kết quả giống nhau thỏa mãn ngƣỡng giá trị mà ngƣời dùng mong muốn.
Stand-alone BLAST version 2.28 là phiên bản đƣợc sử dụng trong khóa luận này, có thể dễ dàng tải về từ địa chỉ web của trang CSDL NCBI
(ftp://ftp.ncbi.nih.gov.blast/executables/).
3.1.2.3. Hệ quả trị CSDL quan hệ MySQL[33]
MySQL là một hệ quản trị CSDL quan hệ nguồn mở phổ biến nhất, dƣới sự phát triển, phân phối và bảo vệ bởi MySQL AB (MySQL AB là một công ty thƣơng mại). Phần SQL của MySQL đƣợc viết tắt từ chữ ”Structured Query Language''. SQL là một ngôn ngữ chuẩn đƣợc dùng phổ biến để xây dựng CSDL và đƣợc công nhận bởi cơ quan tiêu chuẩn SQL là ANSI/ISO công nhận (phiên bản chuẩn của SQL ra đời từ năm 1986 và cho đến nay thì có rất nhiều phiên bản đã tồn tại, “SQL:2003” là phiên bản chuẩn ra đời vào giữa năm 2003, phiên bản này có nhiều ƣu điểm so với các phiên bản trƣớc đó).
Xuất xứ của tên MySQL không rõ. Tiền tố My của MySQL chỉ xuất hiện cách đây khoảng 10 năm nay, có lẽ nó đƣợc lấy từ tên con gái của Monty Widenius (ngƣời đặt nền móng cho sự phát triển của MySQL). MySQL đƣợc viết dựa trên ngôn ngữ C và C++, hoạt động trên nhiều hệ điều hành khác nhau. Phiên bản mới nhất của MySQL là MySQL 5.0.
Ƣu điểm.
Dể sử dụng. Mã nguồn mở.
Thích hợp cho việc xây dựng CSDL vừa và nhỏ. Nhƣợc điểm:
Không thích hợp cho việc xây dựng CSDL lớn. Phiên bản MySQL 4.0.15 đƣợc sử dụng trong khóa luận này.
3.1.2.4. Apache web Server [28]
Trên thế giới hiện nay có rất nhiều trình chủ web hỗ trợ CGI và một trong số đó là Apache web Server. Apache web Server là một trình chủ web đƣợc nhiều ngƣời dùng nhất hiện nay trên Internet. Theo số liệu thăm dò của NetCraft, có trên 60% trình chủ web đang đƣợc sử dụng trên Internet hiện nay là sử dụng Apache web Server. Sở dĩ Apache có đƣợc một vị trí đáng nể nhƣ thế là nhờ vào việc nó là một chƣơng trình mã nguồn mở và hoàn toàn miễn phí. Hai ƣu điểm này đã giúp Apache đƣợc yêu thích đối với những công việc vừa và lớn của nhiều công ty trên thế giới. Hơn thế, Apache hoạt động ổn định, an toàn và đáng tin cậy. Chỉ trong thời gian 5 năm qua, Apache đã trở thành một trình chủ web có chức năng tƣơng đƣơng, thậm chí còn vƣợt trội so với nhiều trình chủ web thƣơng mại khác.
Một trong những điểm mạnh của Apache là khả năng nâng cấp trình chủ web thông qua các module. Có 2 loại module trong Apache đó là external module và internal module. Cả hai loại module này điều có thể đƣợc sửa chữa, thay thế hoặc nâng cấp vì chúng có kèm theo mã nguồn mở. Khi một yêu cầu từ trình tự khách đƣợc gởi đến Apache phải trải qua một loạt nhiều giai đoạn sử lý để cuối cùng trả về kết quả cho ngƣời dùng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Apache có một chế độ bảo mật đáng tin cậy. Quy trình làm việc của Apache cho phép ngƣời dùng thêm mới những module cần thiết vào bất kỳ giai đoạn nào của quá trình xử lý.
Apache 1.3.24 là phiên bản đƣợc sử dụng trong khóa luận này, có thể tải phiên bản này từ địa chỉ (http://httpd.apache.org/download.cgi).
3.1.2.5. Ngôn ngữ lập trình Perl và các gói sử dụng
Trình dịch phiên bản Perl phiên bản 5.6 DBI, DBD::MySQL, CGI.pm
DBI: version 1.37
http://ppm.activestate.com/PPMpackages/zips/6xx-builds-only/ DBD::MySQL version 2.9002
Dùng Perl script tải về lấy tất cả các trình tự có ACCESSION NUMBER của hai gene RT-RNaseHvà hsp-70
Từ khóa
Tách lấy ACCESSION
NUMBER
NCBI
Toàn bộ thông tin về