III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.3. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn gây bệnh
Phương pháp chung được thể hiện qua sơ đồ dưới đây: Mẫu cá
Mổ khám
Ghi nhận các dấu hiệu bệnh tích Lấy mẫu vi khuẩn (gan, thận, não)
Cấy mẫu lên mơi trường NA Xem xét khuẩn lạc
Ghi nhận kết quả
Phƣơng pháp kiểm tra dấu hiệu bên ngồi và mổ khám bệnh tích
-Kiểm tra các dấu hiệu bên ngồi: quan sát cách cá bơi, mắt, vảy, da, vây bụng, hậu mơn và mang của cá bệnh, nhận định sự khác biệt so với cá khỏe.
-Mổ khám bệnh tích bên trong:
+Mổ xoang bụng cá: trước khi tiến hành mổ cá, cá cần được đánh vẩy sạch tại vị trí cần mổ, sau đĩ dùng bơng tẩm cồn 70o
sát trùng thật kĩ tại khu vực mổ để tránh sự nhiễm tạp của các vi khuẩn từ bên ngồi.
-Đặt cá với phần bụng quay về phía người mổ. -Cắt bỏ vây lưng và vây ngực.
-Mổ xoang bụng cá bằng 3 đường cắt:
Đường thứ nhất: bắt đầu từ phía trước hậu mơn cho đến phần đầu, dừng trước nắp mang.
Đường thứ hai: bắt đầu từ trước hậu mơn hướng lên phía trên theo thành bụng tiếp giáp thân về phía đầu đến phần mở của mang cá.
Não cá (màu trắng đục)
Hình 3.1 : Đƣờng cắt giải phẫu xoang cơ thể cá.
-Dùng kẹp đã khử trùng gắp bỏ phần cơ bụng cá đã cắt. -Quan sát các mơ và cơ quan sau:
Quan sát dịch nhầy xoang bụng và màu của dịch nhầy, chất dịch cĩ nhiều hay ít.
Gan: kiểm tra màu sắc, bề mặt, rìa của gan. Lách: như trên
Thận: kiểm tra màu sắc, kích cỡ.
+ Mổ phần đầu cá: dùng kéo cắt một đường ngay phía sau mắt cá, một đường ngay trên đỉnh nắp mang sao cho đối xứng qua sống lưng cá. Chiều dài đường cắt khoảng 1 cm. Cắt bỏ phần cơ và sụn giữa hai đường cắt, sẽ bộc lộ phần não của cá.
Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn
Mẫu vi khuẩn thường được lấy ở gan, thận và não. Trong nghiên cứu này chúng tơi chọn mẫu từ thận và não cá vì sẽ hạn chế được sự nhiễm tạp các vi sinh vật khơng mong muốn từ bên ngồi.
Dùng kẹp gạt các phần nội tạng sang một bên, thận cá nằm sâu trong xoang bụng cá, ngay phía dưới xương sống. Dùng mũi kéo đã khử trùng cắt một vết nhỏ trên thận. Đưa que cấy vịng nhúng vào chỗ cắt, sau đĩ cấy ria trên mơi trường thạch NA. Ủ ở nhiệt độ phịng trong 18 – 24 h.
Đối với mẫu cấy từ não cũng thực hiện tương tự như khi lấy mẫu ở thận. Phƣơng pháp xác định vi khuẩn Streptococcus sp. cĩ trong mẫu
Sau 24h nuơi cấy mẫu, ta tiến hành quan sát màu sắc, hình thái và mật độ của khuẩn lạc đã mọc.
Khuẩn lạc Streptococcus sp. trên mơi trường NA cĩ màu trắng đục, hình trịn, rìa đều, bĩng, lồi thấp, tâm hơi đậm, đường kính từ 0,5 – 0,7 mm.
Chọn khuẩn lạc cĩ đặc điểm trên cấy chuyền sang đĩa mơi trường NA mới, ủ ở nhiệt độ phịng trong 24 h để phân lập dịng vi khuẩn. Từ đĩa cấy chuyền thu được, tiến hành lưu trữ vi khuẩn làm giống trong mơi trường canh NB cĩ bổ sung 50% glycerol (v/v).
Để quan sát hình thái vi khuẩn, ta thực hiện bằng cách: dùng que cấy lấy một ít khuẩn từ một khuẩn lạc cĩ hình thái đặc trưng trên cho lên lam kính cĩ sẵn một giọt nước muối sinh lí, quan sát hình thái vi khuẩn với vật kính 40 của kính hiển vi.
Streptococcus sp. cĩ dạng hình cầu, cĩ thể đứng riêng lẻ, thành từng cặp hoặc tạo thành chuỗi dài. Trong mơi trường canh, Streptococcus sp. cĩ dạng chuỗi dài hơn trong mơi trường thạch.