- Chuyên hỗn hợp dung dịch lên cột thơi gel, li tâm cực đại 1 phút, đỗ địch chảy
Sau khi kiểm tra sản phẩm chọn địng tiễn hành tách plasmid bằng bộ kiít QlAprep ŠSpin Miniprep của hãng QIA gen Các bước tách plasmid:
QlAprep ŠSpin Miniprep của hãng QIA gen. Các bước tách plasmid:
(1)Lấy dịch khuẩn li tâm 3000 vịng/phút, bỏ dịch, lấy cặn
(2) Hồ cặn trong 250 k buffer P1, lắc nhẹ
(3)Bồ sung 250 kh buffer P2 vào ống trên, lắc nhẹ
(4)Bồ sung 350 kl buffer N3, lắc nhẹ tránh để kết tủa cục bộ
(5)Li tâm 13000 vịng/phút trong 10 phút. Hút dịch nổi cho chảy qua cột
tinh sạch plasmid của hãng QIA gen.
(6) L1 tâm 13000 vịng/phút trong I phút, loại bỏ dịch chảy qua cột.
(7) Bỏ sung 500 kl buffer PB, li tâm 13000 vịng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột. dịch chảy qua cột.
(8)Bồ sung 750 LH buffer PE, li tâm 13000 vịng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột. Li tâm bổ sung 1 phút để loại bỏ hết buffer PẸ
26
(9)Đặt cột sang ống 1,5 ml, cho 50 ki EB vào chính giữa cột, để ở nhiệt độ phịng 2 phút và li tâm 13000 vịng/phút trong l1 phút. phịng 2 phút và li tâm 13000 vịng/phút trong l1 phút.
Kểm tra sản phẩm tách plasmid tr ên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dưới ảnh sáng đèn cực tím.
Trình tự của gen cystatin được xác định trên máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM@@ 3100 Advant Genetic Analyzer (Applied Blosystem) sử
dụng bộ hố chất sinh chuân BigDyeŸ Terminator v3.1 cycle sequencing. Gen cystatin dài khoảng 1100 bp nên trình tự nucleotide được đọc cả hai chiều xuơi
Và ngược.
2.3.3. Phương pháp xử lí số liệu
2.3.3.1. Phương pháp thơng kê bằng chương trình Excel
Xác định giá trị trung bình, phương sal, độ lệch chuẩn, sai số trung bình
mẫu ... băng chương trình Excel trên máy vi tính theo Chu Văn Mẫn (2003) [9].
2.3.3.2. Phương pháp xử lý trình tự gen
Sử dụng phần mềm DNAstar, BioEdit để phân tích, so sánh, nối ghép trình
tự gen.
2.3.3.3. Phân tích số liệu trên phần mềm NTSYSpc
Các số liệu nghiên cứu sinh lý và hĩa sinh sử dụng được đề xác định quan
hệ đi truyền của các giống đậu xanh dựa theo phần mềm NTSYSpc (USA,
1998).
2.4. Địa điểm nghiên cứu
Các thí nghiệm được hồn thành tại các phịng thí nghiệm: Phịng thí nghiệm Di truyền - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái nguyên, Phịng thí nghiệm Sïnh học - Khoa Khoa học Tự nhiên và Xã hội - ĐHTN và Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật - Viện Cơng nghệ sinh học.
27