Phƣơng pháp PCR ( Polymerase Chain Reaction) là một công cụ khá mới trong sinh học phân học phân tử, do Karl Mullis và những cộng sự phát minh năm 1985 và đã liên tục hoàn thiện và phát triển trong thời gian gần đây. Kỹ thuật PCR cho phép khuếch đại một đoạn DNA mong muốn lên nhiều lần để phục vụ cho nhiều mục đích khác nhau. Nguyên tắc cơ bản của phƣơng pháp PCR chủ yếu dựa vào khả năng tự nhân đôi, biến tính và hồi tính của DNA.
*Nguyên tắc của phƣơng pháp PCR
Dựa trên khả năng biến tính và hồi tính của DNA cùng với sự phát hiện ra enzyme Taq- polymerase (1 loại DNA polymerase chịu nhiệt), ngƣời ta thiết lập đƣợc hàng loạt các phản ứng nhân đôi DNA in vitro trong một thời gian ngắn. Khi ta làm biến tính (đun nóng) để đoạn DNA tách ra thành 2 mạch đơn và cung cấp 2 mồi chuyên biệt gồm mồi xuôi và mồi ngƣợc bắt cặp bổ sung với 2 đầu đoạn DNA cần nhân lên thì Taq-polymerase sẽ tổng hợp nên 2 sợi DNA mới. Nhƣ vậy nếu phản ứng nhân đôi DNA đƣợc lập lại liên tục nhiều lần thì ta sẽ thu đƣợc một lƣợng khuếch đại rất lớn DNA cần nghiên cứu.
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 giai đoạn:
- Giai đoạn 1: là giai đoạn biến tính (denaturation), nhiệt độ đƣợc nâng lên 93- 100oC. Ở nhiệt độ này tất cả các mạch xoắn kép của DNA đều đƣợc tách ra.
- Giai đoạn 2: là giai đoạn bắt cặp (hybridization), nhiệt độ của phản ứng đƣợc hạ xuống thấp hơn nhiệt độ nóng chảy-Tm của các mồi (là nhiệt độ mà tại đó 2 mạch của sợi đôi DNA tách ra hoàn toàn) cho phép các mồi bắt cặp với DNA khuôn mẫu. Mức nhiệt độ dao động khoảng 40- 70oC, tuỳ thuộc vào Tm của các mồi mà thời gian từ 30 -60 giây.
- Giai đoạn 3: là giai đoạn kéo dài (extension), nhiệt độ đƣợc nhân lên 68-72 oC. Ở nhiệt độ này Taq-polymerase hoạt động tốt nhất để kéo dài các mạch DNA. Đoạn DNA nằm giữa 2 mồi đƣợc tổng hợp.
Cứ sau 1 chu kỳ gồm 3 giai đoạn trên, từ 1 DNA khuôn mẫu sẽ tạo ra 2 DNA mới. Và sau mỗi lần lập lại sẽ làm tăng gấp đôi lƣợng DNA mẫu của lần trƣớc (theo cấp số nhân).
Tổng số DNA đƣợc khuếch đại sau phản ứng PCR đƣợc tính theo công thức: Tổng số DNA khuếch đại = m x 2n
16
PH ẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP