Phƣơng pháp PCR

3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

3.5.5. Phƣơng pháp PCR

3.5.5.1. Khuếch đại vùng 16S – 23S rDNA ITS của vi khuẩn

Phản ứng tiến hành với cặp mồi không chuyên biệt đƣợc thiết kế nhằm khuếch đại trình tự vùng ITS (intergenic spacer sequence) nằm giữa vùng rDNA 16S và 23S (Goncalves và Rosato, 2002):

- Xan 1330 5’ – GTT CCC GGG CCT TGT ACA CAC – 3’ - Xan 322 5’ – GGT TCT TTT CAC CTT TCC CTC – 3’

Thành phần của phản ứng đƣợc thiết lập bao gồm:

Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR Thành phần Nồng độ Nồng độ sau cùng Thể tích ( l) PCR buffer 10X 1X 2,5 dNTP 1 mM 100 M 0,5 MgCl2 25 mM 1,5 mM 0,75 Primer 5 M 0,25 M 2 DNA 25 ng / l 1,25 ng / l 1

Taq polymerase 5 unit / l 0,1 unit / l 0,2

H2O 18,05

Chu kỳ nhiệt của phản ứng đƣợc thiết lập theo bảng sau:

Bảng 3.2 Chu trình nhiệt phản ứng PCR với cặp mồi Xan1330 và Xan322 Giai đoạn Nhiệt độ (0

C) Thời gian Số chu kỳ

Biến tính 94 5 phút 1 Biến tính Bắt cặp Kéo dài 94 58 72 1 phút 45 giây 1 phút 30 Hoàn thành 72 10 phút 1 Giữ mẫu 4 30 phút 1

3.5.5.2. Khuếch đại đọan DNA trong gen hrpF

Với thành phần nhƣ trên, phản ứng PCR đƣợc thực hiện với cặp mồi chuyên biệt, đƣợc thiết kế dựa vào trình tự gen hrpF (Young Jin Park và ctv, 2004).

- XCF 5’ CGATTCGGCCATGAATGACT 3’ - XCR 5’ CTGTTGATGGTGGTCTGCAA 3’

Quy trình nhiệt của phản ứng nhƣ sau:

Bảng 3.3 Quy trình nhiệt phản ứng PCR với cặp mồi XCF và XCR

3.5.6. Phƣơng pháp điện di và đọc kết quả 3.5.6.1. Điện di trên gel agarose

Cho 0,125 gram agarose vào 12,5 ml dung dịch 0,5X TAE

Giai đoạn Nhiệt độ (0C) Thời gian Số chu kỳ

Biến tính 94 5 phút 1 Biến tính Bắt cặp Kéo dài 94 58 72 15 giây 15 giây 30 giây 35 Hoàn thành 72 5 phút 1 Giữ mẫu 4 30 phút 1

Đun sôi hỗn hợp trên khoảng 2 phút trong lò viba (đun 2 lần, mỗi lần 1 phút)

Để nguội đến nhiệt độ khoảng 500C.

Đổ gel vào bể điện di (đặt lƣợc tạo giếng trƣớc khi đổ gel), chú ý tránh bọt khí trên gel.

Để nguội ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút, cẩn thận rút lƣợc ra khỏi gel, cho dung dịch 0,5X TAE vào bể điện di sao cho bảo đảm ngập gel khoảng 1 – 1,5 cm.

Trộn 5 l sản phẩm PCR với 2 l loading dye 6X trên mặt giấy paraffin. Cho hỗn hợp vào các giếng của gel: gồm có giếng thang chuẩn, giếng đối chứng và các giếng chứa các mẫu cần xác định, vận hành máy điện di trong 30 phút ở 100 V và 250 mA.

3.5.6.2. Đọc kết quả điện di

Sau khi điện di ngâm gel trong hỗn hợp ethidium bromide 1 l/ml và TAE 0,5X trong 15 phút.

Rửa lại bằng nƣớc nhiều lần và đặt vào máy chụp gel hiệu Bio-Rad (phần mềm Quantity one 2000).

Ethidium bromide liên kết với DNA sẽ phát sáng dƣới tia UV, kết quả sẽ xuất hiện những băng sáng trên gel.

3.5.7. Phƣơng pháp xác định trình tự gen từ sản phẩm PCR 3.5.7.1. Chuẩn bị khuôn DNA 3.5.7.1. Chuẩn bị khuôn DNA

* Tinh sạch sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch theo quy trình của GFX PCR and Gel band Purification Kit (Amersham). Mục đích của việc tinh sạch là loại bỏ các hóa chất dƣ thừa cũng nhƣ các sản phẩm ký sinh có thể có trong sản phẩm PCR mà quá trình điện di không thể phát hiện đƣợc. Quy trình tinh sạch gồm các bƣớc nhƣ sau:

Điện di 15 l sản phẩm PCR trên gel tan ở nhiệt độ thấp (low melting agarose). Cân một ependorf 1,5 ml và ghi nhớ khối lƣợng.

Sử dụng một mũi dao sạch để cắt band chứa đoạn DNA cần tinh sạch từ gel (thao tác này đƣợc tiến hành dƣới tia UV trong phòng tối), cắt càng sát band chứa

DNA càng tốt, chuyển phần gel chứa DNA vào ependorf đã đƣợc cân từ trƣớc, dùng đầu tip sạch cắt phần gel chứa DNA thành nhiều mảnh nhỏ hơn.

Cân ống ependorf chứa sản phẩm PCR, xác định khối lƣợng của miếng gel.

Thêm 10 l capture buffer cho mỗi 10 g gel (khả năng tối đa của cột dùng cho tinh sạch là 300 l buffer và 300 mg gel).

Vortex nhẹ và ủ ở 600C cho đến khi agarose tan hoàn toàn, thƣờng khoảng 10 – 15 phút.

Trong quá trình ủ, cho một GFX column vào collection tube.

Sau khi agarose hoàn toàn tan, li tâm 400 vòng/phút trong 10 giây để tập trung mẫu xuống phần đáy của ependorf.

Chuyển toàn bộ mẫu vào GFX column (chú ý thao tác nhẹ bằng cách cho mẫu chảy nhẹ theo thành column). Ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 phút.

Li tâm 10000 vòng/phút trong vòng 30 giây.

Lấy GFX column ra, bỏ phần dịch lỏng trong collection tube, cho GFX column vào collection tube trở lại.

Thêm 500 l wash buffer vào (thêm từ từ theo thành column), li tâm 10000 vòng/phút trong vòng 30 giây.

Lấy GFX column ra khỏi collection tube, chuyển vào một eppendoft 1,5 ml đã đƣợc làm lạnh.

Thêm 15 l elution buffer trực tiếp vào giữa màng lọc trong GFX column. Để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút.

Ly tâm tốc độ 10000 vòng/phút trong 1 phút để thu mẫu DNA tinh sạch.

* Định lƣợng DNA tinh sạch

DNA sau khi tinh sạch đƣợc định lƣợng bằng cách chạy điện di sản phẩm tinh sạch cùng với DNA mass và pha loãng tới nồng độ cần thiết (John P. Curran, 2002).

Bảng 3.4 Lƣợng DNA tối ƣu cho phản ứng đọc trình tự

Sản phẩm PCR Lƣợng 100-200 bp 200-500 bp 500-1000 bp 1-3 ng 3-10 ng 5-20 ng

1000-2000 bp 10-40 ng

3.5.7.2. Phản ứng đọc trình tự sử dụng BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) Kit (Applied Biosystems)

* Thành phần hóa chất

Thành phần hóa chất cho mỗi phản ứng đọc trình tự đƣợc thể hiện trong bảng sau:

Bảng 3.5 Thành phần hóa chất cho mỗi phản ứng đọc trình tự

Sản phẩm PCR Lƣợng BDT mix Buffer DNA khuôn (580 bp) Primer Nƣớc khử ion 4 l 2 l 1 l 1 l 2 l Tổng số 10 l

* Chu kỳ nhiệt của phản ứng đọc trình tự

Đặt các ống tube vào Thermal cycler và cài đặt thể tích 10 l. Làm nóng các ống tube ở 950C trong 5 phút.

Bƣớc 1:950C trong 30 giây

Bƣớc 2: 50 - 550C trong 10 giây 25 chu kỳ Bƣớc 3: 600C trong 4 phút

Hạ nhiệt độ xuống 40C và duy trì cho tới khi tinh sạch.

3.5.7.3. Tinh sạch sản phẩm khuếch đại

Mục đích của việc tinh sạch là để loại bỏ dye terminator còn dƣ trƣớc khi điện di. Sử dụng phƣơng pháp tinh sạch của Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa – Sinh: Bổ sung 5 l EDTA 125 mM pH 8 vào mỗi ống sản phẩm PCR. Spin nhẹ.

Thêm vào 60 l ethnol 100 %. Ủ tại nhiệt độ phòng 15 phút.

Thu tủa sau đó rửa tủa bằng 60 l ethanol 70 %. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút.

Loại dịch thu cặn.

Làm khô bằng máy speed vac. Thêm vào 10 l Hidiformamide. Biến tính ở 950C trong 3 phút.

3.5.7.4. Chạy điện di và ghi nhận tín hiệu trên máy sequencer

Sản phẩm DNA sau khi khuếch đại đƣợc load vào các cột mao dẫn chứa polymer để điện di phân tích kết quả.

Kết quả thu đƣợc từ tín hiệu huỳnh quang sẽ đƣợc ghi nhận bằng phần mềm của máy sequencer.

3.5.7.4. Quy trình tóm tắt các bƣớc đọc trình tự

Hình 3.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình đọc trình tự sản phẩm PCR.

Sản phẩm PCR

Tinh sạch GFX PCR DNA and gel

band Purification kit

Phản ứng đọc trình tự Hóa chất: BDT mix Buffer DNA khuôn Primer Nƣớc khử ion Chu kỳ nhiệt: 950C/5 phút 950C/30 giây 550C/10 giây 600C/4 phút 25 chu kỳ Tinh sạch

Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả thu thập và phân lập mẫu vi khuẩn gây bệnh 4.1. Kết quả thu thập và phân lập mẫu vi khuẩn gây bệnh

Qua quá trình khảo sát thực tế tại các ruộng trồng rau, chúng tôi đã tiến hành lấy mẫu và phân lập đƣợc tổng cộng 8 dòng vi khuẩn nhƣ sau:

Bảng 4.1 Danh mục các dòng vi khuẩn sử dụng trong đề tài

Tên mẫu Nơi lấy mẫu Cây kí chủ 1 CC1 Huyện Củ Chi Cải ngọt 2 CC2 Huyện Củ Chi Cải ngọt 3 CC3 Huyện Củ Chi Cải ngọt 4 HM1 Huyện Hóc Môn Cải ngọt 5 HM2 Huyện Hóc Môn Cải ngọt 6 HM3 Huyện Hóc Môn Cải ngọt 7 Q12 – 1 Quận 12 Cải ngọt 8 Q12 – 2 Quận 12 Cải ngọt 9 DC vi khuẩn đối chứng

Xanthomonas axonopodis pv. citri

Bƣởi

Hình 4.1 Lá cải bị bệnh thu thập ngoài ruộng rau.

Hình 4.2 Vết bệnh trên lá cải thu thập ngoài ruộng chụp dƣới kính hiển vi soi nổi.

Hình 4.3 Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trƣờng thạch

(a)vi khuẩn ly trích từ lá bệnh trên môi trường PDA; (b) khuẩn lạc sau khi

phân lập trên môi trường YDC có màu vàng, lồi, bóng, nhầy.

4.2. Kết quả chủng bệnh trên rau cải ngọt trồng trong nhà lƣới

Cây kí chủ sạch bệnh trồng trong nhà lƣới sau khi chủng 4 ngày đƣợc tiến hành quan sát triệu chứng. Kết quả cho thấy các dòng CC1, CC2, CC3, HM1, HM2 và Q12 – 1 gây triệu chứng bệnh trên cây cải ngọt trồng trong nhà lƣới. So sánh vết bệnh tạo ra trên lá cải thu thập ngoài ruộng và lá cải đƣợc chủng trong nhà lƣới, chúng tôi nhận thấy không có sự khác biệt về triệu chứng.

Ở những lá cây nhiễm bệnh, qua hình chụp đốm bệnh dƣới kính hiển vi soi nổi, ta có thể thấy rõ triệu chứng: từ vết thƣơng ban đầu, vi khuẩn xâm nhập các mô, gây hoại tử các mô tế bào lá. Vết bệnh phát triển rộng dần tạo thành đốm màu nâu đen rõ rệt.

Còn ở những lá không bị nhiễm, những tế bào tại vùng bị tổn thƣơng bị chết tạo thành vết sẹo màu trắng, không có triệu chứng bệnh.

a

d b

Hình 4.4 Vết bệnh sau khi chủng và vết thƣơng không bị nhiễm chụp dƣới kính hiển vi soi nổi (a) đốm bệnh trên lá sau khi chủng 4 ngày; (b) vết thương do kim châm tạo ra trên lá không bị bệnh; (c) đốm bệnh trên lá sau khi chủng 4 ngày nhuộm bằng dung dịch Alcohollic lactophenol; (d) vết sẹo ở lá chủng không nhiễm bệnh nhuộm bằng dung dịch Alcohollic lactophenol.

Đốm bệnh

Hình 4.5 Lá cải sau khi chủng bệnh 4 ngày, bên phải gân lá không bị nhiễm và bên trái bị nhiễm (a)lá cải sau khi chủng bệnh 4 ngày; (b) lá cải sau khi chủng bệnh

4 ngày nhuộm bằng dung dịch Alcohollic lactophenol.

4.3. Kết quả ly trích và pha loãng DNA vi khuẩn

Quá trình ly trích DNA vi khuẩn có vai trò rất quan trọng trong nghiên cứu. DNA thu đƣợc phải đáp ứng đƣợc yêu cầu về hàm lƣợng và độ tinh sạch. Sau khi tiến hành tách chiết theo đúng quy trình 8 mẫu vi khuẩn, chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ sau:

Hình 4.6 Kết quả ly trích DNA từ các dòng vi khuẩn (genomic DNA)

1: CC1, 2: CC2, 3:CC3, 4: HM1, 5: HM2, 6: Q12-1, 7: DC.

Qua kết quả điện di ta thấy DNA ly trích có chất lƣợng tốt, lƣợng mẫu nhiều và ít tạp nhiễm. Tuy nhiên, để chuẩn bị tốt cho phản ứng PCR, chúng tôi đã tiến hành pha loãng nhằm hịêu chỉnh nồng độ mẫu DNA bằng dung dịch TE. Kết qủa thu đƣợc thể hiện qua band diện di:

Hình 4.7 Kết quả hiệu chỉnh nồng độ DNA.

DNA thu đƣợc

Phần tạp nhiễm

Thông thƣờng, sản phẩm ly trích phải qua giai đọan tinh sạch bằng enzyme RNAse nhằm đảm bảo cho phản ứng PCR không bị tạp nhiễm. Tuy nhiên, dựa vào hình trên, chúng tôi nhận thấy DNA thu đƣợc có độ thuần khiết cao, do đó, không cần thiết phải tinh sạch.Hơn nữa, quá trình tinh sạch sẽ làm gãy DNA ở một mức độ nào đó.

4.4. Kết quả phản ứng PCR

4.4.1. Kết quả phản ứng PCR khuếch đại vùng ITS

Phản ứng PCR chịu ảnh hƣởng của nhiều yếu tố nhƣ nồng độ DNA, nhiệt độ bắt cặp của primer, nhiệt độ kéo dài, sự cân đối giữa các thành phần của phản ứng. Sau khi hoàn thiện đƣợc quy trình phản ứng PCR đáng tin cậy cho việc khuếch đại đoạn gen trong vùng ITS, chúng tôi tiến hành phản ứng trên các mẫu DNA đã ly trích. Kết quả thu đƣợc rất khả quan. So sánh với thang DNA chuẩn 1,5kb, chúng tôi nhận thấy sản phẩm PCR từ các dòng thu đƣợc là đoạn có kích thƣớc 1,1kb. Kích thƣớc sản phẩm hoàn toàn trùng khớp với nghiên cứu của Goncalves, E.R. và Rosato, Y.B.

Hình 4.8 Kết quả khuếch đại vùng 16S – 23S rDNA

1: CC1, 2: CC2, 3: CC3, 4: Ladder 1,5kb, 5: HM1, 6: HM2, 7: Q12-1, 8: DC.

Sản phẩm PCR này sẽ đƣợc tinh sạch và đọc trình tự. Trình tự DNA có đƣợc sẽ so sánh với dữ liệu trên ngân hàng gen để định danh vi khuẩn gây bệnh.

4.4.2. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR

Chọn hai mẫu CC1 và HM2 để tiến hành tinh sạch theo quy trình GFX PCR and Gel band Purification Kit (Amersham Company).

Cf1 HM2 Hình 4.9 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR. 4.4.3. Kết quả PCR vùng hrpF

Theo Young Jin Park và ctv (2004), primer XCR và XCF thiết kế dựa trên trình tự gen hrpF có tính chuyên biệt cao, dùng để khuếch đại đoạn DNA trong vùng hrpF của vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. campestris có kích thƣớc 535 bp. Chúng tôi đã thực hiện phản ứng PCR dùng cặp mồi trên đối với các dòng vi khuẩn CC1, CC2, HM1, HM2 và Q12 – 1. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:

-Các dòng CC1, CC2, HM2 và Q12 – 1 tạo sản phẩm có kích thƣớc 535 bp, hoàn toàn phù hợp với báo cáo của Young Jin Park và ctv (2004). Do đó, có thể kết luận các dòng vi khuẩn này là Xanthomonas campestris pv. campestris.

-Dòng đối chứng Xanthomonas axonopodis pv. citri không tạo sản phẩm khuếch đại. -Riêng dòng HM2 tạo sản phẩm có kích thƣớc 1 kb. Tuy là kết quả dƣơng tính nhƣng chƣa thể có kết luận định danh đối với dòng vi khuẩn này.

Hình 4.10 Kết quả khuếch đại đoạn DNA vùng hrpF

1: HM1, 2: HM2, 3: CC1, 4: Ladder 1kb, 5: CC2, 6: Q12 – 1, 7: DC.

Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận 5.1. Kết luận

Kết thúc đề tài, chúng tôi đã thiết lập đƣợc quy trình phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây cải ngọt tại Tp. HCM. Quy trình đƣợc thực hiện nhƣ sau:

Thu thập mẫu bệnh tại các vùng trồng rau trọng điểm của Tp. HCM: Tiến hành khảo sát trên ruộng rau, thu thập các mẫu lá xuất hiện các đốm nhỏ màu nâu đen, rửa sạch đất cát, ủ ẩm trong bao ni lông cho vi khuẩn phát triển trƣớc khi phân lập.

Phân lập vi khuẩn từ các đốm bệnh trên lá: Rửa sạch lá bằng nƣớc vòi, mỗi mẫu bệnh chọn các đốm bệnh còn mới màu xanh giọt dầu để phân lập. Khử trùng bề mặt, cắt nhỏ mẫu bệnh ngâm vào nƣớc cất vô trùng 5 – 10 phút. Hút dịch khuẩn cấy trang lên môi trƣờng PDA, ủ ở 28oC trong 24 – 48 giờ. Chọn các khuẩn lạc tròn, màu vàng, nhầy, bóng để phân tích.

Chủng bệnh trên cây cải ngọt sạch bệnh trồng trong nhà lƣới bằng phƣơng pháp tạo vết thƣơng bằng cách xâm kim và nhiễm vi khuẩn trên vết thƣơng.

535 bp 1 kb

Ly trích DNA từ vi khuẩn bằng phƣơng pháp sử dụng CTAB với sinh khối vi khuẩn tăng sinh bằng môi trƣờng LB lỏng.

Phƣơng pháp PCR khuếch đại vùng 16S – 23S rDNA có kích thƣớc 1,1 kb sử dụng cặp primer Xan1330 và Xan322 làm vật liệu giải trình tự. Thực hiện phản ứng với thành phần nêu trong Bảng 3.1 theo chu trình nhiệt Bảng 3.2. Phƣơng pháp PCR dùng cặp primer XCF và XCR khuếch đại đoạn DNA trong vùng hrpF . Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt nhƣ trình bày ở Bảng 3.1 và Bảng 3.3. Phản ứng tạo sản phẩm có kích thƣớc 535 bp khẳng định vi khuẩn gây bệnh thuộc loài Xanthomonas campestris pv. campestris.

Chúng tôi đã xác định đƣợc các dòng CC1, CC2, HM1 và Q12–1 gây bệnh đốm lá trên cây cải ngọt tại Tp. HCM là vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. campestris.

5.2. Đề nghị

Tiến hành khảo sát, nghiên cứu ở quy mô rộng với số lƣợng mẫu phân tích lớn hơn trên các cây rau họ thập tự. Cụ thể là mở rộng địa bàn (Đồng Bằng Sông Cửu Long, Lâm Đồng, Long An và các tỉnh có canh tác rau), nghiên cứu trên phổ kí chủ rộng hơn