Xác định nồng độ các hóa chất, chu trình nhiệt, tỷ lệ tối ƣu giữa primer và DNA mẫu là một trong những yếu tố quyết định sự thành công cho một phản ứng PCR. Nếu tỷ lệ primer/DNA mẫu quá cao sẽ dẫn đến hiện tƣợng các primer tự bắt cặp với nhau tạo ra những băng không mong muốn ở kết quả điện di, nếu tỷ lệ này quá thấp thì sản phẩm PCR tạo ra sẽ không nhiều. Bên cạnh đó, hiện tƣợng bắt cặp (annealing) giả sẽ xuất hiện nếu dƣ thừa lƣợng Mg2+
hoặc Taq DNA polymerase quá dƣ thừa.
Số chu kỳ và chế độ nhiệt cho một phản ứng PCR là rất quan trọng. Nhìn chung, số chu kỳ tùy thuộc vào phƣơng pháp và đối tƣợng nghiên cứu. Nếu thêm nhiều chu kỳ thì phản ứng PCR sẽ kéo dài và sản phẩm thu nhận đƣợc sẽ dễ bị lẫn tạp, không rõ ràng. Ngƣợc lại, nếu quá ít chu kỳ thì sản phẩm DNA đƣợc khuếch đại sẽ không nhiều. Bên cạnh đó, tùy thuộc vào cấu trúc mã di truyền của primer sử dụng mà xây dựng chu trình nhiệt phù hợp.
Ở đây, chúng tôi sử dụng nồng độ các hóa chất, chu trình nhiệt và số chu kỳ cho phản ứng RAPD theo quy trình đƣợc thiết lập bởi Venkatachalam và ctv (2001) đƣợc Bộ Môn Giống - Viện Nghiên Cứu Cao su Việt Nam sửa đổi, đã cho kết quả rất tốt ngay trong lần chạy PCR đầu tiên (Bảng 4.1 và 4.2).
Bảng 4.1: Tỷ lệ và nồng độ các hóa chất tham gia phản ứng RAPD.
Thành phần hóa chất Thể tích ( l) cho 1 mẫu
Nƣớc cất 18,7
10X PCR buffer 2,5
50 mM MgCl2 1,0
10 mM dNTP’s 0,5
5 U Taq DNA polymerase 0,3
9 M Primer 1,0
DNA mẫu 1,0
Tổng 25,0
X: số lần pha loãng
Bảng 4.2: Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD
Bƣớc Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
1 Biến tính 940C 1 phút
35
2 Bắt cặp 300C 1 phút
3 Kéo dài 720C 2 phút
4 Giữ mẫu 40C