Trƣớc khi tiến hành chọn chất hấp phụ trao đổi ion ngƣời ta phải cĩ thơng tin tổng quát về thành phần mẫu cần phân tách. Để phân tách mẫu chứa các phân tử nhỏ nhƣ amino acid, lipid, carbohydrate hay chất sắc tố, ngƣời ta thƣờng sử dụng nhựa trao đổi ion trên nền polystyrene cĩ độ liên kết ngang cao vì các phân tử nhỏ cĩ thể chui vào bên trong hạt. Để tách các phân tử lớn nhƣ peptide, protein, nucleic acid, polysaccharide..ngƣời ta thƣờng sử dụng chất trao đổi ion dạng sợi ít chứa liên kết ngang (dextran và acrylic) cho phép phân tử cĩ kích thƣớt lớn dễ dàng trao đổi ion với chất hấp thụ trao đổi ion.
Trao đổi ion âm
++ + + + + ---
Các phânb tử tích điện âm (anion) bị hấp thu bởi chất trao đổi ion âm.
+ Các phân tử tích điện dương (cation) bị đẩy khỏi chất trao đổi ion âm.
UNO Q Bio-Scale Q Macro-Prep 25 Q
Macro-Prep high Q, DEAE
Hình 2.8 Cơ chế tƣơng tác của chất trao đổi ion âm Trao đổi ion dương
+- - - - - -- Phân tử tích điện dương (cation) bị hấp thu bởi chất trao đổi ion dương
+
Phân tử tích điện âm (anion) bị đẩy khỏi chất trao đổi ion dương
UNO S Bio-Scale S Macro-Prep 25 S
Macro-Prep high S, CM
Các loại nhựa trao đổi ion.
Bảng 2.6 Các loại nhựa trao đổi ion
Loại trao đổi ion Nhĩm chức năng Tên thƣờng gọi
Weak cation exchanger Carboxymethyl CM cellulose/sephadex Strong cation exchanger Sulfopropyl SP sephadex
Weak anion exchanger Diethylaminoethyl DE cellulose/sephadex Strong anion exchanger Quaternary amine QAE sephadex
Sau khi chọn đƣợc chất trao đổi ion, ngƣời ta phải chọn chất trao đổi cation hay anion, điều này phụ thuộc vào các ion cĩ mặt trong phân tử mẫu cần phân tách ở điều kiện tiến hành thực nghiệm. Nếu dịch mẫu chỉ chứa một loại ion thì vấn đề rất đơn giản vì dịch mẫu chứa điện dƣơng, ta chọn chất trao đổi cation và ngƣợc lại. Tuy nhiên, trong thực tế phân tử sinh học luơn chứa các ion khác nhau (cả ion âm và dƣơng) và tổng điện tích của chúng phụ thuộc chủ yếu vào pH của dịch mẫu. Do vậy việc lựa chọn chất trao đổi ion phải theo giá trị pH mà ở đĩ hoạt tính của mẫu đƣợc ổn định nhất.
pI
Khoảng ổn định
Gắn với chất trao Đổi ion dương
+ - Biến tính Lưới Điện tích pH 10 2
Đường cong chuẩn độ Protein
Protein
Khoảng ổn định Biến tính
Gắn với chất trao Đổi ion âm
Hình 2.10 Yếu tố ảnh hƣởng pH trên mạng lƣới trao đổi protein (đƣờng cong chuẩn độ protein)
Theo kinh nghiệm ngƣời ta cĩ thể lựa chọn chất trao đổi ion bằng phƣơng pháp loại trừ nhƣ sau : cho vào các ống nghiệm các loại nhựa trao đổi ion khác nhau (mỗi ống một loại), cho một ít mẫu phân tách vào. Sau đĩ ly
tâm hoặc để lắng, tiến hành xác định chất cịn lại trong dịch cặn (tủa). Nếu dịch cặn chứa ít chất nĩi trên, thì nhựa trong ống nghiệm đĩ là thích hợp. Cũng bằng cách nhƣ trên nhƣng với dịch đệm bổ sung chứa chất cần phân tách theo chiều gradient tăng ngƣời ta cũng cĩ thể xác định đƣợc điều kiện tách cần thiết.
Sự lựa chọn chất trao đổi ion phụ thuộc vào điểm đẳng điện (pI) của protein quan tâm. pI là giá trị pH mà ở đĩ điện tích âm cân bằng với điện tích dƣơng của protein. Thơng thƣờng: pH > pI thì dùng trao đổi ion âm; pH < pI thì dùng trao đổi ion dƣơng.
Bảng 2.7 Chọn chất trao đổi ion. Điểm đẳng điện Ion pH dung dịch đệm
8.5 Cation =< 7.0 7.0 Cation =< 6.0 Anion => 8.0 5.5 Anion => 6.5
(Nguồn: www.bio-rad.com/life science research /chromatography)