3.4.1. Phƣơng pháp tủa phân đoạn bằng muối ammonium sulfate 3.4.1.1. Nguyên tắc [ 5 ] [ 17 ]
Đây là phƣơng pháp hay đƣợc sử dụng nhất. Khi các phân tử muối ammonium sulfate ở dạng hồ tan, cĩ rất nhiều phân tử nƣớc bao quanh các phân tử muối này. Mặc khác trong dung dịch, protein đƣợc bao quanh bởi các phân tử nƣớc. Vì vậy, khi các nồng độ muối trong dung dịch gia tăng thì muối sẽ lấy những phân tử nƣớc này do đĩ cĩ ít phân tử nƣớc tƣơng tác với protein. Đến một lúc nào đĩ sẽ khơng đủ nƣớc để duy trì dung dịch protein nên tạo thành tủa.
Tuy nhiên, các protein khác nhau cĩ độ tan khác nhau và khả năng tủa cũng khác nhau theo sự thay đổi của nồng độ muối, lực ion, pH của mơi trƣờng…
V C C V C V C i i 0 0 0
Trong đĩ : C0: nồng độ ammonium sulfate trong dung dịch ban đầu. V0: thể tích dung dịch ban đầu.
Ci: nồng độ ammonium sulfate trong dung dịch lúc sau. Cα: nồng độ dung dịch ammonium sulfate thêm vào. Vα: thể tích dung dịch ammonium sulfate thêm vào.
Thực tế trong hầu hết các trƣờng hợp, hoạt tính enzyme đƣợc tìm thấy khi tủa ở 35% S - 45% S và 45% S - 55% S.
Do đĩ, chúng tơi tiến hành tủa huyết tƣơng qua 2 giai đoạn : 30% S
50%S.
Hai ƣu điểm của tủa bằng muối ammonium sulfate Cĩ thể loại đến 75% protein thơ.
Dung dịch protein đƣợc cơ đặc.
Để hồ tan protein, cách tốt nhất và đơn giản nhất là làm giảm nồng độ muối trong tủa. Để tránh pha lỗng mẫu, cơng việc cĩ thể tiến hành bằng bao thẩm tích.
Đây là loại bao làm bằng vật liệu polymer, trên bao chứa những vi lỗ cho phép sự khuếch tán xảy ra đối với các phân tử cĩ kích thƣớc nhỏ. Các phân tử protein cĩ kích thƣớc lớn hơn lỗ sẽ khơng thấm đƣợc qua màng nên đƣợc giữ lại trong bao. Nồng độ muối trong bao thẩm tích giảm dần đến khi đạt mức cân bằng giữa trong và ngồi màng thẩm tích.
(http://courses.cm.utexas.edu/jrobertus/ch339k/overheads-1.htm) Hình 3.1. Quá trình thẩm tích
Từ 113,5 ml dịch nổi thu đƣợc sau khi ly tâm ở giai đoạn 1, tiến hành tủa bằng
dung dịch muối ammonium sulfate 100% bão hồ. Nhỏ từ từ 49 ml ammonium sulfate trong điều kiện lạnh, sau đĩ bảo quản ở 4oC trong 24h, lúc này, dung dịch đạt nồng độ cuối là 30% bão hồ, ly tâm thu đƣợc 144 ml dịch nổi.
Sau đĩ, tiếp tục tủa 144 ml dịch nổi với 57,6 ml ammonium sulfate 100% bão
hồ để dung dịch đạt nồng độ 50% bão hồ. Ly tâm thu tủa, rửa tủa nhiều lần bằng ammonium sulfate 50% bão hồ để tủa trắng hồn tồn, thu đƣợc 8 ml tủa
Thẩm tích tủa trong đệm PBS 1X, NaN3 0,05%, pH = 7, tủa tan, ly tâm 3000 vịng / phút, thu 15 ml dung dịch protein.
Từ 15 ml dịch protein thu đƣợc Tiến hành định lƣợng HBsAg
Trích một phần trong dịch thu đƣợc pha lỗng 105 lần trong đệm định lƣợng miễn dịch bằng kit Architect®HBsAg (Abbott).
Đo mật độ quang OD 280 nm của dịch thu đƣợc bằng máy quang phổ ở bƣớc sĩng 280 nm xác định hàm lƣợng protein tổng số.
3.4.2. Phƣơng pháp tinh chế dung dịch protein bằng hệ thống gel lọc - cột Sephacryl S300
3.4.2.1. Nguyên tắc [ 5] [ 13 ]
Là phƣơng pháp dùng để phân tách các phân tử cĩ kích thƣớc, trọng lƣợng phân tử khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel.
Sắc ký lọc dùng những vật liệu là những vi hạt gel cĩ khả năng ngậm nƣớc rất cao. Các hạt gel này là những sợi polymer (polyside, polyacrylamide…) dài, cĩ những cầu nối liên kết ngang để làm giảm bớt độ mềm, chịu đƣợc sức ép khi bị nén mà khơng bị biến dạng, vẫn cho phép dung mơi lƣu thơng.
Trên bề mặt cũng nhƣ phía trong các hạt gel, kích thƣớc của các kẽ khơng gian trống giữa các sợi polymer cho phép các phân tử tan trong dung mơi cĩ thể thấm vào khơng gian trong hạt gel và do đĩ cĩ thể di chuyển quanh co trong cấu trúc của hạt gel.
Hình 3.2. Sắc ký lọc gel
(http://courses.cm.utexas.edu/jrobertus/ch339k/overheads-1.htm)
Khi cho hỗn hợp chứa những phân tử cĩ kích thƣớc khác nhau qua cột sắc ký, chứa những lỗ cĩ kích thƣớc giới hạn nhất định thì các phân tử cĩ kích thƣớc lớn hơn khơng khuếch tán qua lỗ. Do đĩ, chúng sẽ ra khỏi cột trƣớc. Những phân tử nhỏ khuếch tán vào trong lỗ gel và di chuyển trong lỗ gel. Sau đĩ, chúng sẽ đƣợc đẩy ra khỏi cột bằng một dung dịch đẩy.
Sepharyl S 300: là gel agarose, cĩ khả năng phân tách những protein cĩ kích thƣớc từ 104 – 1,5.106Da.
Vì vậy khi cho dung dịch chứa HBsAg qua cột, những phân tử lớn sẽ ra khỏi cột trƣớc. Những phân tử cĩ trọng lƣợng phân tử nhỏ hơn sẽ đi vào trong gel nên ra sau.
3.4.2.2. Tiến hành
Cột gel Sephacryl S300 (dung tích cột V = 180 ml (gel)), rửa cột bằng dung dịch đệm a. Từ 15 ml dịch nổi thu đƣợc ở giai đoạn 3.4.1.2 chúng tơi tiến hành cho qua cột. Khi mẫu qua cột hết, tiến hành rửa cột bằng đệm a đến khi dịch rửa đi ra hết protein (kiểm tra bằng phƣơng pháp Bradford). Cho dung dịch đệm b qua cột để đẩy phần protein bám trên cột ra.
Dịch ra khỏi cột đƣợc đo mật độ quang OD 280 nm để đo hàm lƣợng protein tổng số và thể hiện độ hấp thu dƣới dạng sắc ký đồ, dịch đƣợc thu tự động bằng máy thu, mỗi phân đoạn 5ml, tốc độ dịng 2ml/ phút.
Dựa trên sắc ký đồ hình 4.2
Tiến hành thu các phân đoạn thuộc peak A (ống A11) và ống A10 đƣợc
V = 20 ml.
Trích một phần trong dung dịch thu đƣợc (V= 20ml) pha lỗng 105 lần
định lƣợng kiểm tra hoạt tính HBsAg bằng kit miễn dịch kit Architect®HBsAg (Abbott)
Điện di trên SDS – PAGE 5 – 15% các peak A (ống A11), peak B (ống A12), peak C (ống B8), peak D (ống B5) thu đƣợc.
3.4.3. Phƣơng pháp tinh chế dung dịch protein bằng sắc ký ái lực- cột Sepharose CL – 4B dextran sulfate
3.4.3.1. Nguyên tắc [ 5 ] [ 8 ]
Trong phƣơng pháp này các chất mang trên cột chứa các nhĩm hố học cĩ ái lực đặc biệt với sản phẩm. Vì vậy khi cho một hỗn hợp các chất trong đĩ cĩ chứa sản phẩm đi qua cột, sản phẩm mục tiêu đƣợc gắn một cách chuyên biệt vào chất mang và tất cả các thành phần khác khơng cĩ ái lực với chất mang sẽ đi qua cột nhờ một đệm rửa. Sau đĩ, sản phẩm sẽ đƣợc thu nhờ dung dịch đẩy.
Hình 3.3. Sắc ký ái lực
3.4.3.2. Tiến hành
Cột Sepharose CL – 4B dextran sulfate (dung tích cột V = 20 ml), cân bằng cột bằng dung dịch đệm a, tiến hành cho mẫu V = 20 ml (phần dung dịch thu đƣợc ở giai đoạn 3.4.2.2) qua cột
Sau khi mẫu qua cột hết, cho đệm a qua đến khi dịch rửa đã hết protein. Tiến hành đẩy phần protein bám ra khỏi cột bằng dung dịch đệm b.
Dịch ra khỏi cột đƣợc thu 2 ml/ đoạn, tốc độ dịng 1ml/ phút, đo mật độ quang OD 280 nm của dịch thu đƣợc.
Tiến hành thu phần bám trên cột V = 36 ml
Trích một phần trong dung dịch thu đƣợc (V = 36 ml) pha lỗng 105 lần định lƣợng kiểm tra HBsAg bằng kit miễn dịch kit Architect®HBsAg (Abbott).
Điện di trên gel 15% SDS – PAGE - DTT .
Đo OD 280nm xác định hàm lƣợng protein tổng số
3.4.4. Phƣơng pháp đo mật độ quang OD 280 nm – xác định hàm lƣợng protein tổng số
3.4.4.1. Nguyên tắc [ 5 ]
Phân tử protein hấp thụ ánh sáng cực đại ở bƣớc sĩng 280nm. Sự hấp thụ này cĩ đƣợc chủ yếu là do các amino acid cĩ nhân thơm nhƣ phenylalanine, tryptophan…Tuy nhiên, mỗi protein sẽ cĩ thành phần và số lƣợng các amino acid khác nhau nên mỗi protein sẽ cĩ một hệ số tắt (extintion) tƣơng ứng. Hệ số này là tỷ số giữa độ hấp thụ quang ở bƣớc sĩng 280 nm (A280) trên nồng độ protein.
3.4.4.2 Tiến hành
Mật độ quang của dung dịch đƣợc đo bằng máy quang phổ ở bƣớc sĩng 280 nm.
3.4.5. Phƣơng pháp điện di trên thạch SDS - polyacrylamide gel - kiểm tra mức độ tinh chế
3.4.5.1. Nguyên tắc [ 5 ] [ 6 ]
Kỹ thuật điện di dựa trên nền tảng các phân tử mang điện tích (DNA, RNA, protein…) cĩ khả năng di chuyển khi đặt chúng trong một điện trƣờng.Tốc độ di
chuyển của một protein trong phƣơng pháp điện di dựa vào sự khác biệt: đặc tính, kích thƣớc lỗ gel, trọng lƣợng phân tử, cƣờng độ điện trƣờng, thời gian điện di, nhiệt độ…
Những phân tử cĩ kích thƣớc lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử cĩ kích thƣớc nhỏ khi đi qua một lỗ gel cĩ kích thƣớc nhất định.
Các thành phần đƣợc sử dụng để xây dựng nên giá thể đa phân (polymer) là: acrylamide, N, N’- methylene - bis - (acrylamide), tetramethylenediamine (TEMED) và ammonium persulfate (APS)
Khi tan trong nƣớc, APS tạo nên các gốc tự do theo cơ chế: (S2O8)2- 2SO4
Các gốc tự do này hoạt hố các phân tử acrylamide và N, N’- methylene – bis (acrylamide) tạo thành mạng lƣới polymer liên kết chéo giữa các phân tử này. Khi đĩ, trong mạng lƣới sẽ tạo nên các vi lỗ phụ thuộc vào hai thơng số: (1) nồng độ acrylamide, ( 2) mức độ liên kết chéo.
Nếu nồng độ acrylamide càng cao thì lỗ tạo nên càng nhỏ. TEMED đƣợc thêm vào ở nồng độ 0,4% để xúc tác cho việc tạo gel. Hệ thống đệm giúp duy trì pH trong thùng chứa đệm, trong gel và cĩ vai trị nhƣ một chất điện phân cho phép dẫn dịng điện ngang qua điện trƣờng..SDS cĩ vai trị làm biến tính protein do SDS kết hợp với vùng kị nƣớc của protein và tách chúng thành các tiểu phần, đồng thời làm âm tính hố các tiểu phần này.
Ngồi ra, nếu các tiểu phần của protein gắn kết với nhau bằng các liên kết disulfite, những liên kết này sẽ bị bẻ gãy khi cĩ mặt SDS và β-Mercaptoethanol hay DTT tạo thành nhĩm – SH. Những nhĩm này sau đĩ sẽ bị khố bởi tác nhân alkyl hố để chống lại sự tái tạo liên kết disulfite.
Để tăng hiệu quả phân tách, ngƣời ta đã sử dụng phƣơng pháp điện di khơng liên tục bằng cách dùng hai hệ gel gồm:
Lớp gel tập trung (lớp trên): cĩ vai trị làm cho các đại phân tử tập trung lại tại một vạch xuất phát (bề mặt tiếp xúc giữa hai lớp gel), nồng độ acrylamide thấp.
Lớp gel phân tích (lớp dƣới): là lớp chính dùng để phân tách các đại phân tử trong mẫu, nồng độ acrylamide cao.
3.4.5.2 Tiến hành
Chuẩn bị gel polyacrylamide cĩ nồng độ 5 - 15 % với các thành phần đuợc ghi trong phần 3.2.3.2. Lần lƣợt đổ gel theo thứ tự gel phân tích trƣớc, gel tập trung sau. Các giếng cho mẫu vào đƣợc tạo bằng cách đặt lƣợc vào lớp gel tập trung. Sau khi gel đặc lại, tiến hành lấy lƣợc ra, lắp gel vào bình điện di, cho dung dịch đệm điện di vào.
Thực hiện quá trình điện di, mẫu đƣợc cho vào các giếng, tiến hành chạy (I = 50mA, U = 90V), xử lý gel sau khi điện di bằng cách nhuộm gel với thuốc nhuộm
Coomassie trong khoảng 10 phút. Sau đĩ, tiến hành tẩy bằng cách ngâm gel trong dung dịch tẩy đến khi nền gel trở nên trong suốt.
3.4.1. Phƣơng pháp định lƣợng HBsAg
Dùng kit Architect®HBsAg (Abbott)
3.4.1.1. Khái niệm
Đây là thử nghiệm miễn dịch sử dụng vi hạt phát quang bằng phƣơng pháp hố học. Vi hạt đƣợc gắn với kháng thể HBsAg đơn dịng, dùng để định lƣợng HBsAg trong huyết thanh hay huyết tƣơng.
3.4.1.2. Nguyên tắc hoạt động
Cơ chất phát quang
3.4.6.3. Mục đích của kit Architect®HBsAg (Abbott)
Chuẩn đốn bệnh viêm gan Giám sát tình trạng nhiễm bệnh Chuẩn đốn bệnh cấp tính hay mãn tính 3.4.6.4. Xác định kết quả 3.4.6.4.1. Bố trí Chuẩn: 0 – 250 UI/ ml HBsAg + (1) HBsAg + (2) Chứng âm
Mẫu > 250 UI/ ml pha lỗng 1/500
3.4.6.4.2. Xác định kết quả
Dựa vào đƣờng chuẩn.
3.4.6.5. Đánh giá kết quả thí nghiệm
OD < 0,05 UI/ ml: mẫu khơng phản ứng (HBsAg -) OD > 0,05 UI/ ml: mẫu phản ứng
Kiểm tra lại: xem độ lặp lại bằng test trung hồ dùng kháng thể HBsAg ngƣời trung hồ: HBsAg (+)
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả định lƣợng HBsAg trong huyết thanh
Hoạt tính kháng nguyên HBsAg trong 1ml dung dịch huyết thanh ban đầu đã pha lỗng 105 lần khi định lƣợng bằng kit miễn dịch là: 0,573 mUI.
Vậy hoạt tính kháng nguyên HBsAg trong 113,5 ml huyết thanh ban đầu là: 0,573. 113,5.105 = 6505.103 mUI.
4.2. Kết quả sau giai đoạn tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate bão hồ
Với mục tiêu tinh chế kháng nguyên HBsAg trong huyết thanh vì vậy chúng tơi tiến hành loại các protein khơng mong muốn ra khỏi huyết thanh. Do đĩ, chúng tơi sử dung phƣơng pháp tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate nhằm mục đích loại protein albumin trong huyết thanh.
Đồng thời để xác định hoạt tính kháng nguyên HBsAg trong dung dịch sau tủa ammonium sulfate chúng tơi tiến hành định lƣợng miễn dịch dung dịch bằng kit Architect®HBsAg (Abbott).
Kết quả định lƣợng hoạt tính HBsAg trong 1ml dung dịch sau tủa đã pha lỗng
105 lần là: 1,89 mUI .
Vậy trong 15 ml dung dịch sau tủa ammonium sulfate là:
1,89.15.105 = 2830.103 mUI
Hình 4.1. Kết quả điện di SDS – PAGE 5 - 15 % sau khi tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate bão hồ
Giếng Mẫu Lƣợng mẫu(µg) 1 Albumin chuẩn 5,3
2 Huyết thanh HBsAg(+++) 5,1 3 Dung dịch sau tủa (NH4)2SO4 5,5 4 Albumin chuẩn 5,3 5 Huyết thanh HBsAg (+++) 9,75 6 Dung dịch sau tủa (NH4)2SO4 10,36
Bảng 4.1. Kết quả sau quá trình tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate bão hồ Giai đoạn V (ml) Hoạt tính KN(mUI) Hoạt tính (%) OD OD (%) Hoạt tính/ OD (mUI/OD) Độ tinh khiết (lần) Huyết thanh 113,5 6505.10 3 100 8830,3 100 0,736.103 Sau tủa (NH4)2SO4 15 2830.10 3 43,5 2058 23 1,37.103 1,86
(V(ml) : là thể tích dung dịch protein thu đƣợc sau mỗi giai đoạn.)
Nhận xét
Dựa vào hình 4.1, ta thấy cĩ sự khác biệt giữa các giếng.
Giếng 3, 6 là dung dịch huyết thanh đã qua tủa khơng chứa vạch protein Albumin, trong khi đĩ giếng 2, 5 là dung dịch huyết thanh ban đầu lại chứa vạch protein Albumin.Kết quả này cùng với bảng 4.1 cho thấy:
Giai đoạn tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate đã loại đƣợc phần lớn
albumin cĩ trong huyết thanh.
Từ 113,5 ml huyết thanh ban đầu, sau khi tủa phân đoạn bằng
ammonium sulfate chỉ thu đƣợc 15 ml dịch chứa HBsAg. Vậy thể tích
dung dịch protein đã đƣợc cơ đặc đáng kể.
Hoạt tính kháng nguyên HBsAg so với protein tổng số theo giá trị OD tăng từ 0,736.103 lên đến 1,37.103 (mUI/ OD) và mức độ tinh khiết giai đoạn này là 1,86 lần.
4.3. Kết quả tinh chế HBsAg bằng phƣơng pháp sắc ký lọc - cột gel Sephacryl S300
Do kháng nguyên HBsAg cĩ trọng lƣợng phân tử khá lớn 3.106 Da, lớn nhất trong các loại protein huyết thanh cùng với mục tiêu loại các protein cĩ trọng lƣợng phân tử nhỏ nên chúng tơi sử dụng gel lọc Sepharryl S300 để loại các protein cĩ trong lƣợng phân tử nhỏ, tập trung các protein cĩ trọng lƣợng phân tử lớn.
Gel lọc Sephacryl S300 cĩ kích thƣớc lỗ 104- 1,5.106Da. Do đĩ những protein cĩ
trọng lƣợng phân tử lớn hơn kích thƣớc lỗ gel sẽ ra trƣớc (protein kháng nguyên HBsAg), những protein cĩ kích thƣớc nhỏ hơn hoặc bằng kích thƣớc lỗ sẽ ra sau khi đẩy bằng dung dịch đẩy.
Hình 4.2. Đồ thị sắc ký lọc gel thực hiện trên máy Explorer với cột Sepharcyl S 300
Kết quả định lƣợng hoạt tính kháng nguyên HBsAg trong 1ml dung dịch sau khi qua gel lọc đã pha lỗng 105 lần bằng kit Architect®HBsAg (Abbott) là: 1,5 mUI.
Vậy hoạt tính kháng nguyên trong 20 ml dung dịch thu đƣợc sau qua gel lọc là: 1,5.20.105 = 3000.103 mUI.
Hình 4.3. Kết quả điện di 5 – 15% SDS – PAGE sau khi qua cột Sephacryl S 300 Giếng 1: Huyết thanh HBsAg (+++)
Giếng 2: Huyết thanh sau tủa NH42SO4 Giếng 3: Đoạn A11 (peak A) sau Sephacryl Giếng 4: Đoạn A12 (peak B) sau Sephacryl Giếng 5: Đoạn B8 (peak C) sau Sephacryl S300 Giếng 6: Đoạn B5 (peak D) sau Seephacryl S300
Bảng 4.2. Kết quả sau quá trình thực hiện sắc ký lọc gel trên Sephacryl S 300
Giai đoạn V (ml) Hoạt tính KN(mUI) Hoạt tính (%) OD OD (%) Hoạt tính/ OD (mUI/OD) Độ tinh khiết (lần) Huyết thanh 113,5 6505.10 3 100 8830,3 100 0,736.103