Chỉ tiêu vi sinh vật kiểm tra áp dụng theo TCVN 6096:2004 [1]
+ Đọc kết quả:
Trong một chỉ tiêu, nếu số vi khuẩn hiện diện ≥ 1 hoặc ≤ 2 thì tiến hành kiểm tra lần thứ hai. Nếu số vi khuẩn ≥ 2 thì coi như chỉ tiêu đó không đạt tiêu chuẩn.
+ Biện giải kết quả:
Nếu một mẫu bị vi phạm bất cứ chỉ tiêu nào trong các chỉ tiêu trên thì đều không đạt tiêu chuẩn vi sinh.
Kiểm tra lần đầu Giới hạn
Coliforms tổng số 1x250 ml Không được phát hiện trong
bất kỳ mẫu nào
Nếu ≥ 1 hoặc ≤ 2 thì tiến hành kiểm tra lần thứ hai
Nếu ≥ 2 thì loại bỏ
Coliform fecal hoặc E. coli 1x250 ml
Streptococcus fecalis 1x250 ml
Pseudomonas aeruginosa 1x250 ml
3.4.4. Phƣơng pháp thử nghiệm vi sinh vật
3.4.4.1. Phát hiện và đếm vi khuẩn Coliform, vi khuẩn Coliform fecal và
Escherichia coli giả định
Áp dụng theo TCVN 6187-1:1996; ISO 7899-2:1990(E) [12]. Nguyên tắc
Lọc một lượng mẫu thử qua màng lọc để giữ lại các vi khuẩn, đặt màng lọc trên môi trường nuôi cấy thạch lactoza chọn lọc hoặc một miếng đệm hấp thụ bão hòa bằng môi trường lỏng chọn lọc chứa lactoza.
Nuôi cấy màng lọc trong 24 giờ ở nhiệt độ 350C hoặc 370C để phát hiện vi khuẩn Coliform, hoặc ở 440C để phát hiện Coliform fecal.
Đếm trực tiếp các khuẩn lạc đặc trưng được hình thành trên màng; cấy chuyển các khuẩn lạc đặc trưng để thử nghiệm xác định khả năng sinh khí và sinh indol. Tính toán số vi khuẩn Coliform, Coliform fecal và E. coli giả định có trong 250 ml mẫu.
Môi trường nuôi cấy Môi trường phân lập:
Thạch lactoza TTC với Tegitol 7 Môi trường khẳng định:
Môi trường để kiểm tra sự sinh khí: Nước pepton lactoza Môi trường để kiểm tra sự sinh indol: Nước trypton
Môi trường ống đơn để kiểm tra sự sinh khí và indol: Canh thang manitol lauryl trypto với tryptophan
Thuốc thử:
Thuốc thử Kovac’s để thử indol
Thuốc thử oxidase dùng cho phép thử oxidase
Cách tiến hành
Lọc thể tích nhất định (250 ml) mẫu thử qua màng lọc (0,45 µm) Đặt màng lọc lên đĩa thạch.
Sơ đồ 3.1: Phát hiện và đếm vi khuẩn Coliform, vi khuẩn Coliformfecal và E. coli giả định
Lactose TTC + Tergitol 7
- Nước pepton lactoza (sinh gas) - Thạch dinh dưỡng(thử oxidase)
- Pepton lactoza sinh gas (+) - Thử oxidase (-)
Lactose TTC + Tergitol 7 Ủ (37 ± 0,5)0C/18-24 giờ
- Nước pepton lactoza (sinh gas) - Thạch dinh dưỡng(thử oxidase) - Nước trypton (sinh indol)
Ủ 370C/ 48 giờ
Ủ 440C/ 24 giờ - Pepton lactoza sinh gas (+) - Thử oxidase (-)
Coliforms tổng số - Thử indol (+)
E.coli giả định
Đếm các khuẩn lạc đặc trưng
(vàng, da cam hoặc đỏ gạch)
Chọn khuẩn lạc điển hình/mỗi loại khuẩn lạc cấy sang
một môi trường xác định
Coliforms
Đếm các khuẩn lạc đặc trưng
(vàng, da cam hoặc đỏ gạch)
Chọn khuẩn lạc điển hình/mỗi loại khuẩn lạc cấy sang một môi trường xác định
Coliform fecal và E.coli
Ủ(44 ± 0,25)0C/18-24 giờ
3.4.4.2. Phát hiện và đếm khuẩn liên cầu phân (Streptococcus fecalis)
Áp dụng theo TCVN 6189-2:1996; ISO 7899-2:1984(E) [13]. Nguyên tắc
Đếm liên cầu phân dựa trên việc lọc một thể tích xác định của mẫu nước qua một màng lọc có kích thước lỗ (0,45 µm) thích hợp để giữ lại các vi khuẩn.
Màng lọc được đặt vào môi trường đặc chọn lọc chứa natri nitrua (để ngăn sự sinh trưởng của các vi khuẩn Gram âm) và 2,3,5- triphenyltetrazoli chlorua liên cầu phân sẽ khử thuốc nhuộm không màu thành focmazan màu đỏ. Sau khi nuôi cấy, tất cả khuẩn lạc đã mọc sẽ cho màu đỏ, màu hạt dẻ hoặc màu hồng toàn bộ khuẩn lạc hoặc từ trung tâm, toàn bộ các khuẩn lạc được đếm là liên cầu phân giả định.
Môi trường khẳng định, thạch mật asculin-nitrua, được nuôi trong 48 giờ ở nhiệt độ 440C. Liên cầu phân phát triển trong môi trường này và thủy phân asculin, sản phẩm cuối cùng, 6,7-dihydroxycourmarin sẽ kết hợp với ion Fe3+
cho hợp chất màu nâu vàng tới đen và khuếch tán vào môi trường.
Ngoài ra, tiến hành một phép thử catalase đối với các khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường khẳng định. Những khuẩn lạc cho phản ứng asculin dương tính và catalase âm tính thì có thể xem là liên cầu phân.
Môi trường nuôi cấy Môi trường phân lập:
Môi trường m-enterococcus (Slanetz và Bartley) Môi trường khẳng định:
Thạch mật asculin-nitrua Thuốc thử catalase:
Cách tiến hành
Lọc thể tích nhất định (250 ml) mẫu thử qua màng lọc (0,45 µm) Đặt màng lọc lên đĩa thạch.
Sơ đồ 3.2: Phát hiện và đếm khuẩn liên cầu phân Streptococcus fecalis
Ủ 370
C/ 24h
SLANTZ & BARTLEY
Ủ (37 ± 1)0C/ (44 ± 4)h
Đếm các khuẩn lạc màu nâu đỏ hoặc màu hồng từ trung tâm hoặc toàn bộ khuẩn lạc và cấy chuyển các khuẩn lạc điển
hình sang môi trường
Thạch dinh dưỡng Thạch mật asculin – nitrua (BEA)
Ủ(44 ± 0,5)0
C / 48h Thử catalaza (-)
Xuất hiện khuẩn lạc có màu từ nâu đến đen và/hoặc môi trường bao quanh có màu nâu
hoặc đen
3.4.4.3. Phát hiện và đếm số bào tử kỵ khí khử sunphite (Clostridium)
Áp dụng theo TCVN 6191-2:1996; ISO 6461-2:1986(E) [14]. Nguyên tắc
Lựa chọn các bào tử
Chọn lọc các bào tử có trong mẫu bằng cách đun nóng trong một khoảng thời gian (800C trong 10 phút) đủ để tiêu diệt các vi khuẩn dinh dưỡng.
Lọc qua màng và nuôi cấy
Lọc mẫu nước qua màng lọc có kích thước lỗ sao cho các bào tử vi khuẩn (0,2 m) được giữ lại trên màng lọc.
Đặt màng lọc vào môi trường nuôi cấy chọn lọc xác định (thạch sắt sunphit), tiếp theo ủ ở 370C ± 10C trong 20 ± 4 giờ và 44 ± 4 giờ và đếm các khuẩn lạc có màu đen.
Môi trường nuôi cấy Thạch sunphit triptoza Cách tiến hành
Lọc thể tích nhất định (50 ml) mẫu thử qua màng lọc (0,2 µm) Đặt màng lọc lên đĩa thạch.
Sơ đồ 3.3: Phát hiện và đếm số bào tử kỵ khí khử sunphite (Clotridium)
Thạch - sunphit - tryptoza
Ủ (37 ± 1)0C/(20 ± 4)h và (44 ± 4)h (Ủ trong điều kiện kỵ khí) Đếm các khuẩn lạc màu đen
Bào tử vi khuẩn kỵ khí sunphit
3.4.4.4. Phát hiện và đếm vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa
Áp dụng theo ISO 16266:2006(E) [15]. Nguyên tắc
Lọc một thể tích xác định của mẫu nước qua một màng lọc có kích thước lỗ (0,45 µm) thích hợp để giữ lại các vi khuẩn. Màng lọc được đặt trên môi trường chọn lọc và nuôi cấy trong điều kiện thích hợp.
Sau khi ủ đếm các khuẩn lạc P. aeruginosa giả định trên màng lọc. Các khuẩn lạc tạo sắc tố pyocyanin có màu xanh da trời hoặc màu xanh lá cây được khẳng định là P. aeruginosa, nhưng các khuẩn lạc khác không tạo màu xanh mà lại phát huỳnh quang dưới đèn UV hoặc có màu nâu đỏ cũng yêu cầu khẳng định.
Cấy chuyển các khuẩn lạc cần khẳng định trên màng lọc sang môi trường thạch dinh dưỡng. Sau khi ủ, các khuẩn lạc ban đầu không phát huỳnh quang được thử phản ứng oxidase và các khuẩn lạc có oxidase dương tính được thử khả năng tạo sắc tố và tạo amoniac từ acetamide, các khuẩn lạc ban đầu phát huỳnh quang được thử khả năng tạo amoniac từ acetamide.
Môi trường nuôi cấy Môi trường phân lập:
Thạch Pseudomonas / thạch CN Môi trường khẳng định:
Môi trường King’s B Canh thang acetamide Thạch dinh dưỡng Thuốc thử:
Thuốc thử oxidase Thuốc thử Nessler
Cách tiến hành
Lọc một lượng xác định (250 ml) mẫu thử qua màng lọc (0,45 µm) Đặt màng lọc lên đĩa thạch.
Sơ đồ 3.4: Phát hiện và đếm vi khuẩn P. aeruginosa
Nhỏ 1-2 giọt thuốc thử Nessler (mt chuyển màu vàng đỏ gạch) Khuẩn lạc tạo màu xanh da
trời/ xanh lá cây (pyocyanin) Đếm tất cả
Thạch CN
Khuẩn lạc không tạo màu xanh
Kiểm tra dưới đèn UV
Khuẩn lạc màu nâu đỏ, không phát huỳnh quang
Khuẩn lạc không tạo sắc tố pyocianin, phát huỳnh quang
- Thạch dinh dưỡng - Canh thang acetamide - King’ B
Canh thang acetamide
Ủ (36 ± 2)0C / (22 ± 2)h
Ủ (36 ± 2)0C / (22 ± 2)h
- Oxidase (+) - Sinh amoniac
- Phát huỳnh quang dưới UV Sinh amoniac
3.4.5. Phƣơng pháp làm kháng sinh đồ
Trong nhiều phòng thí nghiệm lâm sàng, phương pháp khuếch tán kháng sinh trong thạch được sử dụng để kiểm tra tính nhạy cảm kháng sinh của các vi khuẩn. Kết quả kháng sinh đồ giúp cho việc điều trị được chính xác và hạn chế việc sử dụng kháng sinh bừa bãi [17][33] [28].
3.4.5.1. Các kháng sinh thử nghiệm
Chọn lựa các kháng sinh thích hợp nhất để thử nghiệm và phúc trình kết quả là một quyết định hay nhất của phòng thí nghiệm lâm sàng để có thể tham vấn được việc trị liệu kháng sinh. Tuy nhiên phòng thí nghiệm có thể tuỳ điều kiện thực tế có thể thêm hay bớt một hay một số kháng sinh. Trong nghiên cứu này chúng tôi thực hiện kháng sinh đồ trên vi khuẩn P. aeruginosa với 16 loại kháng sinh theo tiêu chuẩn NCCLS-2007 (Ủy ban quốc gia về tiêu chuẩn phòng thí nghiệm lâm sàng) và CA-SFM-2004 (Hội đồng kháng sinh – Hiệp hội vi sinh của Pháp).
Bảo quản kháng sinh:
Các đĩa kháng sinh được đóng gói đảm bảo điều kiện không hút ẩm và được giữ ở nhiệt độ 80C hoặc thấp hơn.
Nên lấy các lọ chứa đĩa kháng sinh còn đóng kín ra khỏi tủ lạnh 1 đến 2 giờ để nhiệt độ trong lọ bằng với nhiệt độ phòng thí nghiệm trước khi mở nắp.
Chỉ sử dụng các đĩa còn hạn dùng, loại bỏ các đĩa kháng sinh quá hạn.
Bảng 3-1: Các kháng sinh thử nghiệm trong kháng sinh đồ
(*) National Committee for Clinical Laboratory Standards (2007), Performance standards for anmicrobial susceptibility testing, Seventeenth informational supplement.
(**)Société Française de microbiologie, COMITÉ DE L’ANTIBIOGRAMME DE LA SOCIETE FRANCAISE DE MICROBIOLOGIE, Communiqué 2004.
Họ kháng sinh Tên kháng sinh Viết tắt Hàm lƣợng Kháng Trung gian Nhạy
Beta- lactamin
Penicillin Piperacillin PIP** 75µg ≤17 - ≥18
Ticarcillin/a.clavulanic TCC* 75/10µg ≤14 - ≥15 Cephalosporin Cephem Cefoperazone CFP* 75µg ≤15 16-20 ≥21 Cefsulodin CFS** 30 µg ≤14 15-21 ≥22 Ceftazidime CAZ* 30µg ≤14 15-17 ≥18 Cefepime FEP* 30µg ≤14 15-17 ≥18
Carbapenem Imipenem IPM* 10µg ≤13 14-15 ≥16
Mono-lactamin Aztreonam ATM* 30µg ≤15 16-21 ≥22
Aminoglycosid
Gentamicin GM* 10µg ≤12 13-14 ≥15
Tobramycin TM* 10µg ≤12 13-14 ≥15
Amikacin AN* 30µg ≤14 15-16 ≥17
Polypeptide Colistin CS* 10µg ≤10 - ≥11
Fluoroquinolon Ofloxacin OFX* 5µg ≤12 13-15 ≥16
Ciprofloxacin CIP* 5µg ≤15 16-20 ≥21
Sulfamid Sulfamides SSS** 200µg ≤12 13-16 ≥17
3.4.5.2. Vi khuẩn thử nghiệm
Để chuẩn hóa độ đục của vi khuẩn thử nghiệm, dùng huyền dịch BaSO4 tương đương độ đục chuẩn 0,5 McFarland. Pha độ đục chuẩn BaSO4 0,5 McFarland như sau:
Lấy 0,5 ml dung dịch BaCl2 0,048 M cho vào 99,5 ml H2SO4 0,18 M, vừa cho vào vừa khuấy đều.
Đậm độ chính xác của độ đục chuẩn nên được xác định bằng quang phổ kế đo độ hấp thu với ống đo 1 cm. Độ đục chuẩn 0,5 McFarland phải có độ hấp thu ở bước sóng 625 nm đạt 0,08 đến 0,1.
3.4.5.3. Qui trình thực hiện thử nghiệm kháng sinh đồ
Chuẩn bị vi khuẩn
Chọn một khuẩn lạc riêng rẽ trên mặt thạch phân lập cấy truyền vào môi trường BHI.
Ủ canh khuẩn ở 370C trong 24 giờ, sau đó cấy chuyển vào môi trường thạch dinh dưỡng ủ ở 370C trong 24 giờ.
Lấy một vài khuẩn lạc trên mặt thạch hòa vào nước muối sinh l ý và điều chỉnh độ đục đến khi đạt độ đục chuẩn 0,5 McFarland.
Môi trường thực hiện kháng sinh đồ: Thạch Mueller Hinton Trải vi khuẩn lên mặt thạch
Đặt đĩa thạch vào tủ ấm 15 phút cho khô mặt thạch.
Dùng pipette vô trùng hút khoảng 1 ml (106 vi khuẩn/ml) dịch khuẩn vừa mới pha láng đều trên mặt thạch.
Để 3 đến 5 phút hút bỏ dịch vi khuẩn thừa và để khoảng 15 phút cho khô mặt thạch.
Đặt đĩa kháng sinh lên mặt thạch đã trải vi khuẩn
Dùng kẹp vô trùng gắp các đĩa kháng sinh và ép nhẹ lên mặt thạch để đảm bảo chúng tiếp xúc hoàn toàn với mặt thạch. Số lượng các đĩa kháng sinh không quá 7 đĩa trên hộp thạch có đường kính 90 mm.
Các kháng sinh sẽ khuếch tán ngay sau khi đĩa kháng sinh chạm mặt thạch, vì vậy không nên dời chỗ các đĩa kháng sinh sau khi đã đặt lên mặt thạch.
Trong vòng 15 phút sau khi đặt đĩa kháng sinh phải ủ sấp hộp thạch (đáy trên nắp dưới) trong tủ ấm 370
C.
Đọc và biện luận kết quả: Đo vòng khuyếch tán trên đĩa thạch
Sau khi ủ 18 đến 24 giờ đọc kết quả các hộp thạch. Nếu mặt thạch được trải vi khuẩn đúng cách và mầm cấy đúng độ đục chuẩn, vi khuẩn sẽ mọc thành một lớp mịn và vòng vô khuẩn là một vòng tròn đồng nhất. Đo đường kính vòng vô khuẩn là một vòng, kể cả đường kính đĩa kháng sinh, hoàn toàn không có vi khuẩn mọc thấy được bằng mắt thường. Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẽ hay thước dành riêng cho mục đích này, bằng cách áp thước lên mặt sau của đáy hộp. Khi đọc kết quả tốt nhất là dung ánh sáng xuyên (tức là giữ hộp thạch trên một nguồn sáng).
Biện luận đường kính vòng vô khuẩn dựa theo biện luận đường kính và ghi nhận kết quả vi khuẩn nhạy hay trung gian hay kháng đối với kháng sinh thử nghiệm.
Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Tỉ lệ nhiễm khuẩn của các loại nƣớc uống
4.1.1. So sánh giữa 2 nhóm nƣớc uống (đóng chai và xử lý)
Bảng 4-1: So sánh tỉ lệ không đạt về chỉ tiêu vi sinh giữa 2 nhóm nƣớc
Nước uống đóng chai (nhóm 1) Nước uống xử lý (nhóm 2) Số mẫu % Số mẫu % Đạt 40 80 265 75,7 Không đạt 10 20 85 24,3 Tổng số mẫu 50 350 80 75,7 20 24,3 0 20 40 60 80 100 1 Nhóm 2 % Đạt Không đạt
Biểu đồ 4.1: So sánh sự nhiễm khuẩn giữa 2 nhóm nƣớc
Nhận xét: Nhìn chung mức độ nhiễm khuẩn giữa 2 nhóm nước là như nhau, không khác biệt có ý nghĩa thống kê (P = 0,4 > 0,05; xem them chi tiết ở phụ lục A1)
Bảng 4-2: Tỉ lệ không đạt theo từng chỉ tiêu vi sinh giữa 2 nhóm nƣớc
Nhóm 1 Nhóm 2
Số mẫu không đạt % Số mẫu không đạt %
Tổng số mẫu 50 350 Coliform 5 10 48 13,7 Coliform fecal 4 8 37 10,6 Streptococcus fecalis 1 2 11 3,1 Bào tử vi khuẩn kỵ khí 2 4 18 5,1 P. aeruginosa 8 16 51 14,6 13,7 10,6 3,1 5,1 14,6 0 5 10 15 20 CLs C.F S.F KK P.A % Nhóm 1 Nhóm 2
Biểu đồ 4.2: Tỉ lệ nhiễm từng loại chỉ tiêu vi sinh của 2 nhóm nƣớc
CLs: Coliforms C.F: Coliform fecal
S.F: Streptococcus fecalis KK: vi khuẩn kỵ khí sinh H2S P.A: P. aeruginosa
Biểu đồ 4.3: Tỉ lệ nhiễm từng loại chỉ tiêu vi sinh của 2 nhóm nƣớc
Nhận xét: Nếu xét theo từng chỉ tiêu vi sinh thì nhóm nước uống đóng chai (nhóm 1) bị nhiễm ít hơn nhóm nước uống xử lý (nhóm 2) ngoại trừ chỉ tiêu về P.
aeruginosa, tuy nhiên giữa 2 nhóm nước sự khác biệt chưa có ý nghĩa về mặt thống kê
4.1.2. Giữa các chỉ tiêu trong từng nhóm nƣớc 4.1.2.1. Nƣớc uống đóng chai
Số mẫu khảo sát: 50 mẫu
Số mẫu đạt các chỉ tiêu vi sinh: 40 mẫu, 80% Số mẫu không đạt: 10 mẫu, 20%
Bảng 4-3: Tỉ lệ nhiễm khuẩn của nƣớc uống đóng chai theo từng chỉ tiêu
Chỉ tiêu vi sinh Số mẫu không đạt % không đạt
Coliform 5 10
Coliform fecal 4 8
Streptococcus fecalis 1 2
Bào tử vi khuẩn kỵ khí 2 4
P. aeruginosa 8 16
Nhận xét: Các mẫu nước uống đóng chai đa phần bị nhiễm P. aeruginosa tiếp đến là chỉ tiêu Coliform. Streptococcus fecalis và vi khuẩn kỵ khí khử sunphit tìm thấy không đáng kể.
4.1.2.2. Nƣớc uống công ty
Số mẫu khảo sát: 200 mẫu
Số mẫu đạt các chỉ tiêu vi sinh: 144 mẫu , 72% Số mẫu không đạt: 56 mẫu, 28%
Bảng 4-4: Tỉ lệ nhiễm khuẩn của nƣớc uống công ty theo từng chỉ tiêu
Chỉ tiêu vi sinh Số mẫu không đạt % không đạt
Coliform 32 16
Coliform fecal 25 12,5
Streptococcus fecalis 5 2,5
Bào tử vi khuẩn kỵ khí 10 5
P. aeruginosa 32 16
Nhận xét: Tỷ lệ nhiễm Coliform và P. aeruginosa cao nhất trong các chỉ tiêu, kế đến là Coliform fecal . Cũng giống như nước uống đóng chai Streptococcus fecalis
và vi khuẩn kỵ khí khử sunphit chiếm tỷ lệ thấp hơn trong các mẫu thử.
4.1.2.3. Nƣớc uống gia đình
Số mẫu khảo sát: 50 mẫu
Số mẫu đạt các chỉ tiêu vi sinh: 24 mẫu , 48% Số mẫu không đạt: 26 mẫu, 52%
Bảng 4-5: Tỉ lệ nhiễm khuẩn của nƣớc uống gia đình theo từng chỉ tiêu
Chỉ tiêu vi sinh Số mẫu không đạt % không đạt
Coliform 13 26