3.4.5. Phƣơng pháp điều tra lấy mẫu
Để đảm bảo tính ngẫu nhiên trong quá trình thí nghiệm thì cơng tác điều tra lấy mẫu trên mỗi giống đƣợc thực hiện nhƣ sau:
- Liên hệ bộ mơn Bảo vệ thực vật và bộ mơn giống ở TTNCMĐ để xác định các
giống mía cần thu thập và lấy mẫu.
- Tại mỗi ruộng điều tra (trung bình là 1 hecta) chọn 5 điểm khảo sát.
- Lấy mẫu ngẫu nhiên 5 mẫu/ruộng. 1 mẫu lá (hay mẫu thân) dùng trong phân tích bệnh khảm lá mía hay cằn mía gốc tại 1 điểm điều tra đƣợc lấy ngẫu nhiên
từ 3 cây của 3 hom mía nằm trên 3 hàng xen kẽ nhau (ví dụ nhƣ hàng 1, 3, 5 hay hàng 2, 4, 6) (xem Sơ đồ 3.1).
5 điểm lấy mẫu theo đƣờng chéo gĩc
H1 x x … o x H3 o x … x x H5 x x … o x
Chọn ngẫu nhiên 3 cây trên 3 hàng để lấy mẫu điều
tra Tại 1 điểm điều tra
Sơ đồ 3.1. Sơ đồ điều tra
Chú thích: H1,3,5: Hàng mía điều tra; O: Bụi được kiểm tra; X: Bụi khơng điều tra.
- Mẫu thân mía sau đĩ đƣợc chiết lấy dịch bằng cách đẩy khí: 1 đoạn thân cây
mía (khoảng 10 – 20 cm) đƣợc chặt ra, dùng một ống bơm đẩy dịch chiết từ đầu này sang đầu kia, thu dịch chiết cho vào eppendorf cĩ ghi nhãn cẩn thận về mẫu nhƣ giống, tuổi cây, triệu chứng.
- Mẫu lá và dịch chiết nƣớc mía đƣợc cho vào thùng xốp giữ lạnh và đem về trữ
ở TTPT Đại học Nơng Lâm.
3.4.6. Phƣơng pháp phát hiện SCMV bằng kỹ thuật ELISA 3.4.3.1.Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu và bố trí thí nghiệm
Chuẩn bị chày cối (hấp nƣớc DEPC) để khơ ở tủ âm trƣớc khi nghiền mẫu, pha dung dịch đệm ly trích mẫu (từ 20X xuống 1X). Khi nghiền mẫu thì cắt nhỏ mẫu ra bằng kéo (cĩ sự vơ trùng bằng cồn sau mỗi lần cắt mẫu) để dễ dàng nghiền mẫu. Cụ thể quy trình làm đƣợc tĩm tắt ở Sơ đồ 3.2.
1
2
5
Mẫu lá mía
Cân 0,5 g Cắt nhỏ
Cho vào cối nghiền + Extractionbuffer (2,5ml)
Nghiền
Cho dịch nghiền vào eppendorf
Li tâm ở 4OC, 3 phút, 7000 vịng/phút
Hút dịch trong chuyển sang eppendorf mới
Trữ ở tủ mát 4OC
Sơ đồ 3.2. Sơ đồ tách chiết mẫu lá cho ELISA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B Substrate BF 1 4 7 10 13 16 19 22 25 C Substrate BF 1 4 7 10 13 16 19 22 25 D Substrate PC 2 5 8 11 14 17 20 23 26 E Substrate PC 2 5 8 11 14 17 20 23 26 F Substrate NC 3 6 9 12 15 18 21 24 27 G Substrate NC 3 6 9 12 15 18 21 24 27 H
Sơ đồ 3.3. Sơ đồ bố trí giếng trên đĩa ELISA
Chú thích: Subs: Substrate; PC: Positive control; BF: Buffer extraction; 1, 2, 3,.v.v.: Mẫu chẩn đốn; NC: Negative control
Chuẩn bị đĩa và sơ đồ bố trí mẫu trên đĩa, mỗi đĩa đƣợc bố trí: 2 giếng đối chứng dƣơng, 2 giếng đối chứng âm, 2 giếng dung dịch đệm (buffer), 6 giếng chứa chất nền (substrate), cịn lại là các giếng chứa mẫu cần phân tích. Tuy nhiên để đảm bảo tính chính xác cao trong quá trình thực hiện phản ứng, chúng chúng tơi chỉ tiến hành vơ mẫu lá phân tích trong 54 giếng (từ B3 - G11). Mỗi mẫu đƣợc lặp lại 2 lần trên 2 giếng kề nhau theo chiều dọc của đĩa ELISA (Sơ đồ 3.3).
3.4.3.2. Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA
Quy trình đƣợc thực hiện nhƣ sau:
- Bƣớc 1: Pha lỗng kháng thể đa dịng trong dung dịch đệm đến nồng độ 1/100.
Cho hỗn hợp trên vào giếng BF, NC, PC và các giếng mẫu với thể tích 100 μl/giếng. Các giếng substrate đƣợc thay bằng nƣớc cất siêu lọc với thể tích
tƣơng đƣơng trong suốt quá trình phân tích. Ủ đĩa ở 37OC trong vịng 2 giờ. Sau
đĩ rửa đĩa 3 lần với dung dịch PBS - Tween bằng máy rửa ELISA.
- Bƣớc 2: Cho 100 μl dịch đệm ly trích vào mỗi giếng BF, pha đối chứng dƣơng
và đối chứng âm trong 1ml nƣớc cất siêu sạch, cho 100 μl đối chứng âm vào giếng NC và 100 μl đối chứng dƣơng vào giếng PC. Với các giếng mẫu, cho
100 μl dịch trích mẫu ở giai đoạn ly trích vào mỗi giếng. Ủ đĩa ở 4OC qua đêm.
Rửa đĩa 3 lần với dung dịch PBS - Tween bằng máy rửa ELISA.
- Bƣớc 3: Pha dung dịch kháng thể gắn enzym đến nồng độ 1/100. Cho 100 μl
hỗn hợp trên vào giếng BF, NC, PC, và các giếng mẫu. Ủ đĩa ở 37O
C trong vịng 2 giờ. Rửa đĩa 2 lần bằng dung dịch PBS - tween bằng máy rửa ELISA.
- Bƣớc 4: Hịa tan pNPP dạng viên trong dung dịch đệm, cho vào tất cả các giếng
substrate, BF, NC, PC và các giếng mẫu với thể tích 100 μl/giếng. Ủ đĩa ở 37O
C trong 30 phút, đọc kết quả bằng máy đọc ELISA hoặc quan sát sự đổi màu của giếng bằng mắt thƣờng. Sau 30 phút, 1 giờ, 2 giờ đọc lại kết quả ELISA.
Các mẫu lá mía đƣợc chẩn đốn cĩ nhiễm bệnh hay khơng dựa vào:
- Sự đổi màu trong phản ứng DAS-ELISA: giếng nào nếu màu vàng giống mẫu
đối chứng dƣơng thì mẫu đĩ dƣơng tính (+), bị nhiễm SCMV. Các giếng khơng màu trùng với giếng đối chứng âm là mẫu âm tính (-), sạch bệnh khảm lá mía.
Cách tính kết quả:
- Giá trị OD của mẫu = giá trị OD thơ - giá trị OD trung bình của các giếng Substrate.
- Mẫu dƣơng tính: Nếu giá trị OD của mẫu > giá trị ngƣỡng.
- Mẫu âm tính: Nếu giá trị OD của mẫu < giá trị ngƣỡng.
(Giá trị ngƣỡng = 2 x giá trị OD trung bình của các giếng đối chứng âm).
- Một số mẫu cĩ giá trị OD gần ngƣỡng thì khơng chắc chắn là dƣơng tính vì vậy
cần đọc kết quả sau 30 phút, 1 giờ, 2 giờ để cĩ đƣợc kết quả chính xác.
3.4.7. Phƣơng pháp nhận dạng bệnh cằn mía gốc trên đồng ruộng
Quan sát đồng ruộng, trên từng ruộng mía, với thời gian trồng và chặt sau khi thu hoạch xong thì sự sinh trƣởng của các cây khơng đều, cĩ cây cao, cĩ cây thấp. Kiểm tra các cây thấp chậm phát triển này cĩ bị bệnh cằn mía gốc hay khơng bằng cách dùng dao bén chặt dọc thân cây mía và quan sát sự đổi màu của các bĩ mạch.
Chỉ tiêu quan sát
- Cây sinh trƣởng và phát triển chậm hơn bình thƣờng, nếu cây bị bệnh đứng gần
cây khỏe mạnh thì rất dễ dàng nhận diện.
- Cĩ hay khơng sự đổi màu của các bĩ mạch bên trong thân cây mía.
- Đốt thân ngắn, đƣờng kính thân giảm so với bình thƣờng.
3.4.8. Phƣơng pháp phát hiện vi khuẩn Lxx bằng kính hiển vi và bằng
phƣơng pháp nhuộm STM
Dịch nƣớc mía sau khi chiết đƣợc đem kiểm tra bằng kính hiển vi. Làm tiêu bản mẫu dịch chiết nƣớc mía trên lam kính. Đậy lamen và quan sát vi khuẩn Lxx dƣới kính
hiển vi ở độ phĩng đại là 1000 lần (xem dƣới giọt dầu). Vi khuẩn Lxx cĩ hình gậy,
chiều rộng từ 0,25 - 0,35 x 1 - 4 μm, nổi lên trên nền tối của kính hiển vi.
Cây mía đƣợc 10 tháng tuổi thì mới cĩ thể kiểm tra đƣợc bằng phƣơng pháp STM, quy trình đƣợc thực hiện nhƣ sau: Nhổ cây mía sau đĩ chặt sát gốc cắm vào dung dịch
thuốc nhuộm safranin (thành phần gồm Safranin 10%, cồn 96O và nƣớc cất). Để khoảng
30 phút lấy ra và gọt lấy phần ruột mía phía trong (cách gốc khoảng 5 cm). Gọt mỏng ngang thân mía đem soi trên kính hiển vi ở độ phĩng đại 40 - 100 lần, thu đƣợc kết quả các mạch dẫn cĩ màu đỏ hoặc màu vàng. Chỉ tiêu đánh giá nhƣ sau:
- 70 – 84,9 % mạch đỏ: Giống nhiễm trung bình.
- 85 – 99,9 % mạch đỏ: Giống nhiễm nhẹ.
- 100 % mạch đỏ: Giống khỏe mạnh.
(Trích dẫn: Hà Đình Tuấn, 2004).
3.4.5. Phƣơng pháp nuơi cấy và nhận dạng khuẩn lạc vi khuẩn Lxx
Thành phần mơi trƣờng nuơi cấy vi khuẩn Lxx gồm các thành phần sau:
Thành phần hấp - Nƣớc cất = 1000 ml - Bacto agar = 17 g - Pepton = 8 g - K2HPO4 = 1 g - KH2PO4 = 1 g - MgSO4.7H2O = 0,2 g Thành phần lọc - Glucose = 0,5 g - Methionine = 1 g - Nalidixic acid = 0,01 g - BSA = 2 g - Cysteine = 0.1 g
Albumin huyết thanh bị, cysteine, methionine, nalidixic acid và glucose đƣợc lọc vơ trùng và thêm vào các thành phần mơi trƣờng trên sau khi chúng đã đƣợc hấp vơ trùng (thêm vào khi nhiệt độ < 50OC), pH chỉnh về 6,6 với NaOH hay HCl.
Đổ mơi trƣờng vào đĩa petri (khoảng 15 ml/đĩa). Cấy vi khuẩn bằng cách dùng pipet hút 1ml mẫu dịch chiết nƣớc mía nhiễm bệnh đem cấy lên đĩa mơi trƣờng. Dịch chiết nƣớc mía nuơi cấy đƣợc chiết bằng cách đẩy khí và xác định sự hiện diện của vi khuẩn
Lxx bằng kính hiển vi và nhuộm STM. Dịch chiết sau đĩ đƣợc trải rộng khắp đĩa nhằm
mục đích thu đƣợc khuẩn lạc đơn lẻ cấy chuyền sang mơi trƣờng khác. Mẫu dịch chiết đƣa vào nuơi cấy đƣợc pha lỗng ở mức độ 0 lần, 2 lần, 4 lần, 6 lần, 8 lần, và 10 lần. Đĩa cấy sau đĩ đƣợc ủ ở 28OC trong thời gian 3 tuần. Theo dõi sự phát triển của khuẩn lạc vi khuẩn hàng ngày.
Chỉ tiêu theo dõi
- Thời gian hình thành khuẩn lạc Lxx trên mơi trƣờng nuơi cấy (20-22 ngày).
- Khuẩn lạc Lxx sau 20 ngày nuơi cấy cĩ màu trong suốt, kích thƣớc khuẩn lạc là
từ 0,1 – 0,3 mm (Davis, 1980).
3.4.6. Phƣơng pháp PCR phát hiện vi khuẩn Lxx
Phƣơng pháp chuẩn bị DNA mẫu cho PCR trực tiếp: Dịch chiết từ thân mía
(100 μl) đƣợc đem ly tâm 20.000 vịng trong 10 phút ở nhiệt độ phịng. Dịch lắng thu đƣợc rửa hai lần bằng nƣớc cất vơ trùng (100 μl) trƣớc khi tái huyền phù lại với nƣớc cất vơ trùng (100 μl). Tồn bộ dung dịch đƣợc đun sơi trong vịng 5 phút và làm lạnh nhanh trong vịng 10 phút. Một thể tích khoảng 2 μl của dịch này đƣợc nhƣ mẫu để chạy phản ứng PCR
PCR phát hiện Lxx dựa vào cặp mồi và quy trình của Stevens Brumbley
(2003) gồm các thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt cho ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Thành phần các chất trong phản ứng PCR và chu kỳ nhiệt
Sản phẩm PCR sau phản ứng đƣợc điện di trên gel agarose 1,5 % (w/v), với ethidium bromide trong dung dịch đệm TAE 1X , hiệu điện thế là 90V trong 20 phút.
Chỉ tiêu đánh giá: Sự xuất hiện băng DNA khuyếch đại chuyên biệt (520 bp) của vi khuẩn trên gel điện di.
Thực hiện phản ứng PCR
- Thí nghiệm 1: PCR sử dụng quy trình chuẩn bị mẫu, thành phần các chất phản ứng, và chu kỳ nhiệt do S. Brumbley (2003) đƣa ra.
Hĩa chất Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích/ phản ứng( μl) Chu kỳ nhiệt Bufer MgCl2 dNTPs Primer F Primer R PVP Taq DNA polymerase DNA mẫu H2O 10X 25 mM 25 mM 2,5 μM 2,5 μM 5U/1 μl 1X 3 mM 0,24 mM 0,25 μM 0,25 μM 1% w/v 1 U 2,5 3 0,24 2,5 2,5 2,5 0,2 2 9,56 96 – 5 phút – 1 chu kỳ 94 – 15 giây 57 – 30 giây 40 chu kỳ 72 – 30 giây 72 – 10 phút – 1 chu kỳ Tổng thể tích 25 μl
- Thí nghiệm 2: Khảo sát hiệu quả của hai phƣơng pháp chuẩn bị mẫu: Biến tính bằng nhiệt và li trích DNA vi khuẩn Lxx.
Đo OD sản phẩm dịch chiết biến tính và thêm vào thành phần phản ứng PCR
Lọc dịch chiết bằng màng lọc 0,4 μm trƣớc khi biến tính
Thực hiện li trích DNA Lxx trong dịch chiết theo quy trình ly trích vi khuẩn.
- Thí nghiệm 3: Khảo sát hiệu quả sử dụng của PVP trong PCR trực tiếp từ dịch chiết nƣớc mía. Tăng nồng độ PVP trong phản ứng PCR lên 1,5 – 2 lần.
- Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của các thành phần phản ứng và chu kỳ
nhiệt trong phản ứng PCR.
Tăng lƣợng mẫu DNA đƣa vào. Tăng nồng độ primer.
Tăng nồng độ primer kết hợp với tăng nồng độ Taq polymerase.
Giảm nhiệt độ bắt cặp của primer xuống 2O
C.
Giảm nồng độ MgCl2.
Giảm nồng độ MgCl2 kết hợp với giảm nhiệt độ bắt cặp.
Phƣơng pháp đổ gel agarose điện di
+ Bƣớc 1: Chuẩn bị gel agarose 1-2%.
+ Bƣớc 2: Làm nguội agarose đã đƣợc nấu chín đến 50 – 60OC, sau đĩ đổ vào
khuơn đã đƣợc đặt lƣợc vào trƣớc.
+ Bƣớc 3: Lấy lƣợc ra, cho gel vào 1×TAE.
+ Bƣớc 4: Hút 2 µl loading dye trộn với 4 µl mẫu.
+ Bƣớc 5: Bơm vào các giếng một cách cẩn thận 4 µl mẫu + dung dịch đệm.
+ Bƣớc 6: Chạy điện di ở ở hiệu điện thế 90V/20 phút, cho đến khi thuốc nhuộm cách đầu tận cùng của gel là 1 cm.
+ Bƣớc 7: Lấy gel ra và ngâm vào dung dịch ethidium bromide (0,5 µg/ml) trong 20 phút.
+ Bƣớc 8: Rửa nhẹ gel dƣới vịi nƣớc chuyên dụng.
+ Bƣớc 9: Đọc kết quả dƣới tia UV, thẩm định kết quả với marker.
Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA
Kiểm tra và phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA trên 6 giống mía sản xuất và 10 giống nhập nội tại TTNCMĐ.
Kiểm tra bằng phƣơng pháp nhìn trực tiếp bằng mắt thƣờng: quan sát sự đổi
màu của các giếng tuy nhiên trong 5 đĩa phân tích thì chỉ thấy giếng đối chứng dƣơng xuất hiện màu vàng, cịn tất cả các giếng cịn lại đều khơng cĩ màu. Kết quả lập lại tƣơng tự sau khi kiểm tra lại sau 30 phút, 1 giờ, 2 giờ (hình 4.1).
- Kết luận: Tất cả các mẫu chẩn đốn đều âm tính (-) với SCMV.
A
B
Hình 4.1. Kết quả chẩn đốn SCMV qua quan sát sự đổi màu trên đĩa ELISA.
Chú thích: A: 2 giếng đối chứng dương cĩ màu vàng B: 2 giếng đối chứng âm khơng màu.
Kiểm tra bằng máy đọc ELISA: Kết quả cho ra âm tính với tất cả các mẫu phân tích, ngoại trừ đối chứng dƣơng (PC) là ra kết quả dƣơng tính (+). Kết quả cho tƣơng tự khi đọc lại sau 30 phút, 1 giờ, 2 giờ.
- Kết luận: Tất cả các mẫu chẩn đốn đều âm tính (-) với SCMV.
Từ kết quả phân tích ELISA là âm tính cho tất cả các mẫu này, ta cĩ thể kết luận rằng, các giống mía đƣợc điều tra cĩ kết quả âm tính với bệnh khảm lá mía. Điều này chứng tỏ bệnh khảm lá mía khơng xuất hiện trên các giống khảo sát. Kết quả này cũng phù hợp với những điều tra trƣớc đây về sự phân bố của bệnh là diễn ra ít hơn tại các vùng nhiệt đới (Lê Lƣơng Tề, 1999), và thực tế là các cuộc khảo sát gần đây tại TTNCMĐ đều cho kết quả là cĩ rất ít giống bị bệnh khảm (Hà Đình Tuấn, 2004;
Trƣơng Lê Bạch Liên, 2005). Kết quả gĩp phần thống kê tình hình nhiễm bệnh khảm lá mía trên các giống mía sản xuất khảo sát. Đặc biệt là, kết quả nghiên cứu cĩ ý nghĩa quan trọng trong cơng tác kiểm định các giống mía Thái Lan mới nhập nội năm 2005. Theo kết quả kiểm tra ELISA thì tất cả các giống mía Thái Lan nhập nội đều khơng bị nhiễm SCMV, từ đĩ cho phép tiến hành những nghiên cứu sâu hơn trong cơng tác lai tạo và chọn giống để thu đƣợc các giống mới năng xuất cao và sạch bệnh. Tuy nhiên kết quả trên vẫn chƣa khẳng định đƣợc trên tất cả các giống đã đƣợc kiểm tra ở trên nĩi riêng và các giống mía khác tại TTNCMĐ nĩi chung là khơng bị nhiễm bệnh đƣợc. Nguyên nhân cĩ thể giải thích là do:
- Kỹ thuật ELISA chỉ cĩ tác dụng định tính chứ khơng cĩ tác dụng định lƣợng, do
đĩ nếu trong mẫu cĩ hàm lƣợng virus tồn tại ở nồng độ thấp, khơng đủ độ nhạy cho ELISA phát hiện thì kết quả khi phân tích ELISA sẽ là âm tính (-). Cho nên kết quả ELISA này chỉ cĩ ý nghĩa trong một mức độ giới hạn nào đĩ và để cĩ kết quả chính xác hơn cần tiến hành phân tích với số lƣợng mẫu nhiều hơn trong cùng