Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (Completely Randomized Design, CRD), một yếu tố, 2 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại. Mỗi nghiệm thức gồm 8 chồi dứa hủy đỉnh sinh trưởng.
Các bƣớc tiến hành : Các bước tiến hành sau đều giống nhau ở các thí nghiệm - Bước 1: Hấp khử trùng riêng từng bộ phận của bình bioreactor
- Bước 2: Hủy đỉnh sinh trưởng của 8 chồi dứa và đưa chồi dứa đã hủy đỉnh sinh trưởng bỏ vào bình bioreactor.
- Bước 3 : Gắn đầu lọc vào 2 đầu dây silicone tạo thành hệ thống kín vô trùng - Bước 4 : Dùng băng keo quấn quanh nút cao su thật chặt.
Từ bước 2 đến bước 4 thực hiện trong tủ cấy vô trùng.
*Các chỉ tiêu theo dõi :
-Trọng lượng tươi trung bình(g) : Trọng lượng tươi của tất cả các mẫu sau khi loại bỏ hết nước bám quanh mẫu/8
-Trọng lượng khô trung bình(g) : Trọng lượng tươi tất cả các mẫu được sấy ở nhiệt độ 37oC trong 72 giờ/tổng số mẫu
-Hệ số nhân chồi: tổng số chồi tạo ra/8.
-Chiều cao chồi(cm) : tính từ rễ cho đến lá cao nhất của chồi dứa.
Thí nghiệm 1:Khảo sát hiệu quả nhân chồi dứa bằng bioreactor sục khí.
Thí nghiệm 1a: Ảnh hưởng của thể tích môi trường đến khả năng nhân chồi dứa bằng bioreator sục khí liên tục
Bảng 3.1 Các nghiệm thức của thí nghiệm 1a
Nghiệm thức Thể tích môi trƣờng(lít)
1 1
2 1,5
Thí nghiệm 1b: Ảnh hưởng của thể tích môi trường đến khả năng nhân chồi dứa bằng bioreactor sục khí gián đoạn (10phút/1chu kỳ)
Bảng 3.2 Các nghiệm thức của thí nghiệm 1b
Nghiệm thức Thể tích môi trƣờng(lít)
1 1
2 1,5
* Ngoài các bước tiến hành chung ở trên cần tiến hành gắn thêm timer vào hệ thống, bơm sục khí gián đoạn 10 phút/1 chu kỳ ( 10 phút sục khí, 10 phút nghỉ)
Thí nghiệm 2: Khảo sát thời gian ngâm chìm định kỳ thích hợp cho việc nhân chồi cây dứa.
Bảng 3.3 Các nghiệm thức của thí nghiệm 2
Nghiệm thức Thời gian ngâm chìm(phút/giờ)
1 10 phút/1giờ 2 10 phút/2giờ
* Ngoài các bước tiến hành chung ở trên cần tiến hành gắn bình TIB vào hệ thống điều khiển tự động đã được thiết kế.
3.5 Xử lý số liệu :
Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Thiết kế hệ thống tự động cho bioreactor sục khí và ngâm chìm định kỳ (TIB)
4.1.1Thiết kế hệ thống tự động bioreactor sục khí
Hệ thống được thiết kế đã hoạt động tốt. Khí được sục qua các lỗ kim trên thành ống silicone tạo thành các bọt khí, cung cấp oxy cho môi trường.
Hình 4.1-Bioreactor sục khí
4.1.2 Thiết kế hệ thống bioreactor ngâm chìm định kỳ tự động
Dựa trên nguyên lý hoạt động của bioreactor ngâm chìm định kỳ(TIB) mạch điện được thiết kế với mục đích tự động hoá quá trình trên :
T4A T2B T1 T1A T3A T2B T1B T2 T3 T3A T3B T4 Bo m B Van V K CHÚ THÍCH -T: timer -1,2,3,4:số thứ tự timer -Kí hiệu A :cổng ra của timer -Kí hiệu B : cổng ra của timer
-Bom : máy bơm sục khí - Van : van solenoid 3 lỗ -K : công tắc nguồn -Kí hiệu :thường đóng -Kí hiệu :thường mở -Kí hiệu : cuộn dây của timer.
Hình 4.2- Sơ đồ mạch điện thiết kế cho TIB tự động
*Giải thích mạch điện : Khi đóng nguồn thì T1 hoạt động để bơm khí vào bình 1 trong một thời gian quy định, sau đó T1 tắt và T2 mở làm cho máy bơm ngừng hoạt động trong một thời gian đã định. Tiếp đó T2 nghỉ và T3 hoạt động đồng thời valve 3 chiều cũng mở theo làm dòng khí đi qua bình 2(thay vì qua bình 1 như lúc trước) sau trong một thời gian đã định. Tiếp đó, T3 nghỉ và bơm ngừng hoạt động đồng thời T4 hoạt động làm cho máy bơm ngừng hoạt động trong một thời gian đã định . Cuối cùng T4 nghỉ và T1 lại họat động, lặp lại chu kỳ như trên.
Hệ thống tự động này tiết kiệm được 1 máy bơm thay vì 2 máy bơm nhờ sử dụng van solenoid 3 lỗ, đồng thời tiết kiệm được sức lao động trong quá trình canh thời gian để chạy máy bơm, bên cạnh đó có thể chủ động được thời gian cho môi trường qua lại giữa 2 bình một cách hiệu quả.
4.2 Kết quả thí nghiệm.
4.2.1 Thí nghiệm 1 : Khảo sát hiệu quả nhân chồi dứa bằng bioreactor sục khí liên tục.
Thí nghiệm 1a:Ảnh hưởng của thể tích môi trường đến khả năng nhân chồi dứa bằng bioreator sục khí liên tục
Bảng 4.1- Các chỉ tiêu theo dõi của thí nghiệm 1a
Nghiệm thức MT lỏng sục khí liên tục 1L MT lỏng sục khí liên tục 1,5L Trọng lƣợng tƣơi trung bình(g) 3,12 3,75 Trọng lƣợng khô trung bình(g) 0,3 0,35 Hệ số nhân chồi 12,5 13,5
Chiều cao chồi(cm)
2,15 2,32
Đặc điểm hình thái
Lá bị đen, cứng, dòn tích nhiều nước, không có hiện tượng thủy tinh thể
Lá bị đen, cứng, dòn tích nhiều nước, không có hiện tượng thủy tinh thể
Bảng 4.2-Ảnh hưởng của yếu tố thể tích đến hệ số nhân chồi của cây dứa Cayenne trong bình bioreactor sục khí liên tục
Nghiệm thức Hệ số nhân chồi
SỤC LIÊN TỤC THỂ TÍCH 1L 10,97a SỤC LIÊN TỤC THỂ TÍCH 1,5L 14,10b
Nhận xét :
-Kết quả nhận được cho thấy với cùng một mẫu cây dứa như nhau khi xử lý với thể tích khác nhau cho kết quả tăng chồi trung bình khác nhau. Khi phân tích trên thống kê cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa giữa 2 phương pháp.
-Mẫu chồi dứa trong bình thể tích 1,5 lít có số chồi tăng hơn so với thể tích 1 lít. Giải thích điều này là do trong thể tích 1,5 lít lượng chất dinh dưỡng cần thiết cho việc nhân chồi nhiều hơn so với thể tích 1 lít. Với hệ thống ngâm chìm định kỳ, Escalona và cộng sự (1999) chứng minh rằng thể tích tối ưu cho nhân chồi dứa là 200 ml/mẫu cấy. Sử dụng thể tích lớn hơn đã làm giảm hệ số nhân chồi. Lorenzo và cộng sự (1998) khi nhân chồi Saccharum spp. trong hệ thống bioreactor bình đôi BIT® cũng đã chứng minh khi tăng dần thể tích môi trường từ 5,0 đến 50,0 ml/mẫu cấy, hệ số nhân chồi tăng từ 8,3 chồi lên đến 23,9 chồi sau 30 ngày nuôi cấy.
Sục khí liên tục Sục khí gián đoạn 10’/1lần
Hình 4.4-Chồi dứa sau 4 tuần nuôi cấy trong bình bioreactor sục khí liên tục và sục khí gián đoạn.
Thí nghiệm 1b: Ảnh hưởng của thể tích môi trường đến khả năng nhân chồi dứa bằng bioreactor sục khí gián đoạn (10phút/1chu kỳ)
Bảng 4.3-Các chỉ tiêu theo dõi của thí nghiệm 1b
Bảng4.4-Ảnh hưởng của yếu tố thể tích đến hệ số nhân chồi của cây dứa Cayenne trong bình bioreactor sục khí gián đoạn
Nhận xét :
-Kết quả trên cho thấy phương pháp sục khí gián đoạn với 2 thể tích khác nhau cho kết quả thống kê khác nhau.
Nghiệm thức Sục khí gián đoạn 1L Sục khí gián đoạn 1,5L
Trọng lƣợng tƣơi trung bình (g) 0,71 0,96 Trọng lƣợng khô trung bình (g) 0,078 0,11 Hệ số nhân chồi 11 7,25
Chiều cao chồi(cm) 1,3 1,63
Đặc điểm hình thái Lá bị đen, cứng, dòn tích nhiều nước, không có hiện tượng thủy tinh thể
Lá bị đen, cứng, dòn tích nhiều nước, không có hiện tượng thủy tinh thể
Nghiệm thức Hệ số nhân chồi
SỤC KHÍ GIÁN ĐOẠN 1L 11,13a
-Trong phương pháp sục khí gián đoạn lượng oxy cung cấp cho mẫu cây dứa không đủ. Do vậy, bình 1,5L có thể tích lớn hơn nên lượng oxy trung bình cung cấp cho mẫu dứa không bằng lượng oxy trung bình cung cấp cho bình 1L. Kết quả là mẫu cây dứa không thể phát triển cũng như sử dụng chất dinh dưỡng một cách hiệu quả.
Oxygen chỉ hòa tan một phần trong nước (0,25 mmol l-1 ở 25oC, 1 atm, oxygen chiếm 21% thể tích không khí) nên để đáp ứng nhu cầu oxygen cho sự phát triển của mô thực vật, một lượng lớn oxygen cần được khuếch tán vào môi trường nuôi cấy. Những yếu tố liên quan đến vấn đề hòa tan oxy gồm có độ thoáng khí, tốc độ khuấy đảo, hình dạng cánh khuấy, độ hòa trộn không khí và kết cấu của bioreactor. Ngoài ra, mức độ đảo trộn của mẫu cấy cũng là một yếu tố cần quan tâm do oxygen hòa tan trong môi trường cần nhanh chóng được mô, tế bào hấp thu. Tóm lại, để đáp ứng tốt nhất nhu cầu oxygen cho sự phát triển của mô và tế bào thực vật, lượng oxygen hòa tan trong dung dịch nuôi cấy luôn phải lớn hơn ngưỡng oxygen hòa tan cực đại mà tế bào mô hấp thu (DO2 htcđ). Trong thực tế, người ta căn cứ vào giá trị DO2htcđ để thiết kế bioreactor và giá trị này cũng là yếu tố được quan tâm hàng đầu khi tiến hành phóng đại hệ thống lên quy mô lớn hơn (Leather, 1995)
4.2.2 Thí nghiệm 2 : Ảnh hưởng của thời gian ngâm chìm định kỳ đến khả năng nhân chồi dứa bằngTIB. nhân chồi dứa bằngTIB.
Bảng 4.5-Các chỉ tiêu theo dõi của thí nghiệm 2
Nghiệm thức MT lỏng ngâm chìm định kỳ 10'/1h MT lỏng ngâm chìm định kỳ 10'/2h Trọng lƣợng tƣơi trung bình(g) 2,07 4,73 Trọng lƣợng khô trung bình(g) 0,15 0,287 Hệ số nhân chồi 14,83 21,25
Chiều cao chồi (cm)
2,27 2,76
Đặc điểm hình thái
Cây con phát triển tốt, lá xanh ,mềm,không tích
nước, không có hiện tượng thủy tinh thể
Cây con phát triển tốt, lá xanh ,mềm,không tích
nước, không có hiện tượng thủy tinh thể
Chồi dứa sau 4 ngày nuôi Chồi dứa sau 4 tuần nuôi
Bảng 4.6-Ảnh hưởng của yếu tố thời gian ngâm chìm đến hệ số nhân chồi của cây dứa Cayenne trong bình bioreactor TIB
Nhận xét:
Hiệu quả nhân chồi ở 2 nghiệm thức là khác nhau. Hệ số nhân chồi trung bình của nghiệm thức 10’/2h(10 phút trong chu kỳ 1h) có kết quả vượt trội so với nghiệm thức 10’/1h. Kết quả trên cũng là một điều hợp lý. Vì cây dứa vốn là loại thực vật thích hợp với điều kiện khô ráo thoáng khí. Do vậy khi ngâm chìm với tần số 10’/1h làm cho cây dứa phát triển không tốt, hiệu quả nhân chồi không cao. Krueger và cộng sự (1991) đã chứng minh được tầm quan trọng của tần số ngập chìm lên hiệu quả nhân chồi ở cây “serviceberry”. Cây bị mọng nước khi xử lý ở chế độ ngập chìm 5 phút/30 phút (5 phút ngập trong chu kỳ 30 phút), và không bị mọng nước khi xử lý ngập chìm 5phút/60phút. Tuy nhiên, chế độ xử lý 5 phút/30 phút lại tốt cho sự nhân về số lượng chồi. Từ đó, tác giả đề nghị sử dụng chu kỳ 5phút/30phút ở giai đoạn đầu nuôi cấy để nhân số lượng và áp dụng chu kỳ sau 5phút/60phút để duy trì chất lượng chồi. Qua thí nghiệm này, tác giả cũng quan sát được khoảng thời gian thích nghi của thực vật khi thời gian ngập chìm bị thay đổi.
-Thí nghiệm cho thấy cây dứa thích hợp với điều kiện ngâm chìm 10phút/2giờ hơn so với 10phút/1h.
-Trong quá trình tiến hành thí nghiệm có một sự khác biệt so với một số tác giả khi thiết lập hệ thống : sử dụng bông gòn lót ở mặt dưới đáy giúp cho việc giữ môi trường dinh dưỡng lâu hơn. Còn ở thí nghiệm của một số tác giả : sử dụng một miếng lưới lót phía dưới dẫn tới chất dinh dưỡng được rút hết toàn bộ.
Nghiệm thức Hệ số nhân chồi
TIB 10’/1H 14,78a
HỆ SỐ NHÂN CHỒI 0 5 10 15 20 25 SKLT 1L SKGĐ 1L SKLT 1,5L SKGĐ 1,5L TIB 10'/1h TIB 10'/2h
Hình 4.6-Biểu đồ hệ số nhân chồi CHÚ THÍCH : SKLT 1L : sục khí liên tục 1lít
SKGĐ 1L : sục khí gián đoạn 1 lít
SKLT 1,5L : sục khí liên tục 1,5 lít
SKGĐ 1,5L : sục khí gián đoạn 1,5 lít
TIB 10’/1h : ngâm chìm định kỳ 10 phút/1 giờ
TIB 10’/2h : ngâm chìm định kỳ 10 phút/2 giờ
*Nhận xét : Biểu đồ trên cho thấy phương pháp nuôi cấy ngâm chìm định kỳ (TIB) cho hiệu quả nhân chồi cao hơn hẳn so với phương pháp nuôi cấy sục khí. Đặc biệt, tần số ngâm chìm đình kỳ 10’/2h cho hiệu quả cao nhất.
Phần 5.KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 Kết Luận :
Hệ thống bioreactor đã chứng tỏ khả năng nhân sinh khối với nhiều ưu điểm. Tuy nhiên, mỗi loại cây cần có một kiểu bioreactor thích hợp.Trong các kiểu bioreactor đó, TIB đã cho thấy những ưu điểm phù hợp với sự phát triển của cây dứa. Từ những kết quả đạt được có thể kết luận như sau :
+Bioreactor sau khi thiết kế đã hoạt động tốt
+Hình thức nuôi cấy cây dứa bằng bioreactor sục khí là không phù hợp cho sự phát triển của cây dứa.
+Thể tích môi trường 1,5L cho kết quả khả quan hơn so với thể tích 1L khi nuôi cấy bằng bioreactor sục khí liên tục.
+Bioreactor sục khí liên tục giúp cho cây dứa phát triển tốt hơn so với bioreactor sục khí gián đoạn.
+Bioreactor ngâm chìm định kỳ là loại bioreactor phù hợp cho sự phát triển của cây dứa.
+Thời gian ngâm chìm định kỳ 10 phút/2h là thích hợp hơn cho cây dứa.
+Cây con ở bioreactor ngâm chìm định kỳ có hình thái đẹp (lá xanh non, không bị đen) hơn so với bioreactor sục khí.
5.2. Đề nghị :
-Cần khảo sát thêm thời gian ngâm chìm đình kỳ thích hợp nhất cho khả năng ra chồi của cây dứa.
-Nghiên cứu quá trình thay đổi thành phần môi trường trong quá trình nuôi cho phù hợp với sự tăng sinh chồi của cây dứa.
-Nghiên cứu cải tiến thêm hệ thống bioreactor ngâm chìm định kỳ, khắc phục các nhược điểm của hệ thống, kiểm soát và điều khiển một cách tự động các yếu tố ảnh hưởng tới sự phát triển của cây dứa(pH, không khí, dinh dưỡng...)
-Tiếp tục nghiên cứu quá trình đưa cây dứa ra ngoài vườn sau thời gian nuôi cấy thích hợp.
-Nghiên cứu ứng dụng hệ thống bioreactor ngâm chìm định kỳ cho các đối tượng khác như : chuối, tiêu...
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1.Dương Công Kiên, 2002. Nuôi cấy mô thực vật. NXB Đại học Quốc gia Tp.HCM. 2.Dương Tấn Nhựt và csv, 2004. Nuôi cấy lỏng và nuôi cấy thoáng khí trong việc gia tăng sinh khối và năng cao chất lượng cây hoa lily (Lilium longiflorum). Tạp Chí Công Nghệ Sinh Học, 2(4), 487 – 499
3.Nguyễn Thành Hải, 2005. Nghiên cứu chế tạo bioreactor mô hình phục vụ công tác nhân giống nhanh cây cây hoa Thu hải đường (Begonia tuberous) – một loài hoa có giá trị kinh tế cao. Khoá luận cử nhân khoa học, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tp.HCM
4.Nguyễn Đức Lượng và Lê Hồng Thủy Tiên, 2002. Công nghệ Tế bào. NXB Đại học Quốc gia, Tp.HCM
5. Tôn Bảo Linh, 2005. Nghiên cứu tạo cây dứa Cayenne in vitro sạch virus gây bệnh héo đỏ đầu lá (PMWaV- Pineapple mealybug wilt associated virus). Khóa luận tốt nghiệp khoa Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm, Tp. HCM
TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI
6.Aitken-Christie J., 1991. Automation. In: Debergh P.C. & Zimmerman R.J.(eds).
Micropropagation: Technology and Application. Kluwer Academic
7.Alvard D., Cote F.&Teisson C., 1993. Comparison of methods of liquid medium cultures for banana micropropagation. Effects of temporary
immersion of explants. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 32, 55 – 60.
8.Debergh P., 1988. Improving mass propagation of in vitro plantlets. In: Proceedings of the International Symposium on High Technology in Protected
Cultivation, Tokyo, 45 – 57.
9.Escalona M. và csv, 1999. Pineapple (Ananas comosus L. Merr) micropropagation in temporary immersion systems.(Plant Cell R ep)
10.E. Firoozabady · N. Gutterson, (2003). Cost-effective in vitro propagation methods
for pineapple (Plant Cell Rep)
11.Gawel N.J & Robacker C.D, 1990. Gossypium hirsutum genotypes in semi-solid
12.Hammerschlag F , 1982. Factors affecting establishment and growth of peach shoots in vitro. HortSci., 17, 85 – 86
13.Jones A.M. & Petolino J.F., 1988. Effects of support medium on embryo and plant production from cultured anthers of soft-red winter wheat. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 12, 243 – 261.
14.Lian M.L., Chkrabarty D. & Peak K.Y, 2002 Growth and the uptake of sucrose and