E: xanh đốm nâu gai viền.
4.2. Đánh giá đa dạng nguồn gen bằng kiểu gen 1 Kết quả kiểm tra chất lƣợng DNA
4.2.1. Kết quả kiểm tra chất lƣợng DNA
Để thực hiện phản ứng PCR-RAPD nồng độ DNA được pha loãng từ 20 – 50 ng / µl cho phù hợp với lượng DNA cần thiết để thực hiện phản ứng PCR. Theo Antoni Raflski và một số tác giả khác thì nồng độ DNA thích hợp để chạy phản ứng PCR-RAPD từ 5 – 50 ng / 1 phản ứng (Antoni Rafalski và ctv, 1994).
Các mẫu DNA của 50 dòng dứa sẽ được kiểm tra chất lượng trên môi trường agarose gel 0,8 % trong TAE 1X. Nếu DNA hiện diện trên gel không rõ và bị đứt đoạn thì cần phải tiến hành ly trích lại. DNA tốt khi xuất hiện những vạch sáng và mỏng. Kết quả kiểm tra được thể hiện trong hình 4.5.
Hình 4.5: Chất lƣợng DNA của các dòng dứa Cayenne trên gel agarose 0.8 %. 4.2.2. Sản phẩm phản ứng PCR với marker RAPD
Để phát hiện sự đa hình, 13 primer đã được sử dụng trong phản ứng PCR trên DNA genome thu được từ các mẫu lá của 50 dòng dứa Cayenne. Sản phẩm khuếch đại tạo ra từ những primer này được quan sát trên gel agarose 1.5%. Kết quả quan sát cho thấy chỉ có 9 primer cho sản phẩm khuếch đại, với 38 allen đa hình được tạo ra trung bình 4,28 allen / 1 primer, sản phẩm khuếch đại có kích thước từ 0,3 – 3 kb (bảng 4.3). Dựa vào sự khác biệt giữa các allen thể hiện qua các băng trên gel ta có thể xác định được sự khác nhau giữa các dòng dứa về mặt di truyền.
Bảng 4.3: Danh sách các primer sử dụng trong phân tích đa dạng di truyền của dứa Cayenne STT Ký hiệu Trình tự 5’ ... 3’ Số băng phát hiện Kích thƣớc (kb) Ghi chú
1 OPD 02 GGACCCAACC 4 0,3 – 1,3 Primer từ bộ kit
2 OPA10 GTGATCGCAG 4 0,2 – 1,5 Primer từ bộ kit
3 RAPD3 GTAGACCCGT 4 0,2 – 3 Primer viện thiết kế
4 OPC15 GACGGATCAG 4 0,3 – 2,5 Primer từ bộ kit
5 RAPD2 GTTTCGCTCC 5 0,7 – 1,6 Primer viện thiết kế
6 RAPD4 AAGAGCCCGT 6 0,75 – 1,5 Primer viện thiết kế
7 RAPD6 CCCGTCAGCA 3 1,1 – 2,5 Primer viện thiết kế
8 AJ01 ACGGGTCAGA 3 0,4 – 1,018 Primer từ bộ kit
- Primer RAPD3: Sản phẩm khuếch đại được tạo ra với primer này là 4 và cả 4 sản phẩm đều đa hình, có kích thước từ 0,2 – 3 kb (hình 4.6a). Trong đó có duy nhất 3 băng có kích thước 3 kb ở các dòng Cayenne như OMK20 (11), OMK11 (13), OMK16 (19). Đều này có thể cho thấy sự khác biệt về di truyền của các dòng dứa này so với những dòng khác. Đối với primer này thì có 50 % số dòng dứa tạo sản phẩm khuếch đại, trong đó phần lớn các dòng dứa Hà Nội đều không tạo sản phẩm.
- Với primer RAPD4 số lượng băng tạo ra là 6, có kích thước từ 0,75 – 1,5 kb, và đều là băng đa hình, có một vị trí băng duy nhất ở mẫu số 20: OMK44 có kích thước 1,05 kb (hình 4.6b). Primer RAPD4 cũng ít có sản phẩm với dòng dứa Hà Nội và có 48 % số dòng dứa cho sản phẩm với các băng đa hình thể hiện rỏ trên gel.
Hình 4.6: Kết quả điện di sản phẩm PCR với primer RAPD3 và RAPD4 trên gel agarose 1,5 %
Chú thích : số 1 - 25 tương ứng với danh sách giống ở bảng 3.1, a: sản phẩm với primer RAPD3, b: sản phẩm với primer RAPD4.
- Với primer OPC15 có 4 sản phẩm khuếch đại được tạo ra có kích thước từ 0,3 – 2,5 kb, số băng đa hình là 4 và có một băng duy nhất xuất hiện ở mẫu 19: OMK16 do đó có thể phân biệt được dòng này với các dòng dứa khác (hình 4.7). Số dòng cho sản phẩm khuếch đại là 25 chiếm 50 % tổng số và sản phẩm dễ nhận biết trên gel. Những dòng OMK61 – OMK75 không có sản phẩm với primer này.
Hình 4.7: kết quả điện di sản phẩm PCR với primer OPC15 trên gel agarose 1,5%
- Primer RAPD2: số lượng dòng dứa cho sản phẩm khuếch đại ít chiếm 36%, với 5 băng đa hình được tạo ra có kích thước từ 0,7- 1,6 kb. Primer này cũng không cho sản phẩm khuếch đại với các dòng dứa Hà Nội (hình 4.8).
Hình 4.8: kết quả điện di sản phẩm PCR với primer RAPD2 trên gel agarose 1,5%.
- Tương tự đối với primer OPA04 tạo ra 5 băng đa hình có kích thước từ 0,3 – 2,5 kb (hình 4.9) và OPA10 có 4 băng đa hình có kích thước từ 0,2 – 1,5 kb (hình 4.10) cũng cho thấy sự đa dạng về nguồn gen giữa những dòng trong cùng một giống. Cả hai marker này cũng ít có sản phẩm với những dòng dứa có nguồn gốc từ Hà Nội và không có sản phẩm duy nhất. Các băng đa hình tạo ra rõ và dể dàng thấy được sự khác biệt giữa các dòng.
Hình 4.9: kết quả điện di sản phẩm PCR với primer OPA04 trên gel agarose 1,5%
Hình 4.10: kết quả điện di sản phẩm PCR với primer OPA10 trên gel agarose 1,5%.
- Ngoài ra, primer RAPD6 với 3 sản phẩm khuếch đại có kích thước từ 1,1 – 2,5 kb, primer OPD02 với 4 sản phẩm đa hình được tạo ra có kích thước từ 0,3 – 1,3 kb cũng cho thấy sự khác biệt về di truyền giữa các dòng dứa Cayenne. Trong tổng số những primer khảo sát thì primer AJ01 có số lượng dòng dứa có sản phẩm khuếch đại PCR thấp nhất chỉ chiếm 18 % trên tổng số dòng thí nghiệm và số băng đa hình được tạo ra là 3 băng với kích thước từ 0,4 – 1,018 kb. Đối với primer này thì các dòng dứa Hà Nội có sản phẩm khuếch đại. Hiệu quả tạo sản phẩm PCR của primer này không cao so với các primer khác có thể do bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố trong phản ứng PCR như lượng DNA, nồng độ Taq polymerase, đều này đã được chứng minh bởi Boonsermuk và ctv (1997).
Từ kết quả phân tích sản phẩm PCR với 9 primer cho thấy các primer đều tạo ra các băng đa hình có thể phân biệt được sự khác biệt về di truyền giữa các dòng dứa trong cùng một giống và số lượng dòng dứa có đa hình cũng khác nhau ở từng primer (bảng 4.4). Primer OPA10 cho đa hình với số lượng dòng cao nhất (58 %) và thấp nhất là AJ01 (18 %), RAPD4 có số lượng allen tạo ra trên một dòng cao nhất. Trong 50 dòng dứa Cayenne nghiên cứu thì các dòng có nguồn gốc từ Hà Nội ít có sản phẩm khuếch đại. Do vậy, đối với các dòng dứa này cần phải tiếp tục chọn lựa các marker khác để kiểm tra thêm. Số lượng sản phẩm PCR tạo ra đối với những primer thì còn phụ thuộc nhiều vào đều kiện phản ứng PCR (Ellsworth và ctv, 1993) cho nên chỉ có một số primer cho ra các băng đa hình. Bên cạnh đó, một số sản phẩm PCR khó nhận diện trên gel có thể do số lượng sản phẩm khuếch đại ít nên băng bị mờ hoặc thời gian nhuộm với ethiumbromide ít vì vậy việc thu thập các dữ liệu để phân nhóm cần tiến hành cẩn thận.
Bảng 4.4: Sự đa hình của 9 primer với 50 dòng dứa Cayenne
Primer Cấu trúc primer Vị trí allen Số dòng tạo băng Tỉ lệ (%)
OPD 02 Đa hình A, B, C,D 21 42 % OPA10 Đa hình A, B, C, D 28 56 % RAPD3 Đa hình A, B, C, D 25 50 % OPC15 Đa hình A, B, C, D 25 50 % RAPD2 Đa hình A, B, C, D, E 18 36 % RAPD4 Đa hình A, B, C, D, E, F 24 48 % RAPD6 Đa hình A, B, C 23 46 % AJ01 Đa hình A, B, C 9 18 % OPA04 Đa hình A, B, C, D, E 23 46 %
Bên cạnh đó, có một đều lý thú khi phát hiện đa hình trên các primer kết hợp với xem xét kiểu hình cho thấy những primer trong nghiên cứu này có thể tách được hai nhóm dứa với hình dạng lá có gai và không có gai dựa trên những băng đa hình khác nhau trên từng primer (bảng 4.5).
Bảng 4.5: Sự khác biệt về kiểu gen giữa dòng dứa có gai và không có gai dựa vào sự đa hình của các primer
Tên dòng OPD02 OPA10 RAPD3 OPC15 RAPD2 RAPD4 RAPD6 OPA04
OMK44* OMK19 OMK19 C No D A, B B, C, D No C, D B, C, D D, E No D, E A, C, D No A, B, C A, B, C, D, E No OMK8* OMK36 A, D C C, D B, C, D B, C, D A, B, D B, C, D A, C, D D, E D B, C, E E A, B, C A A, B, C A, B, C, D, E
Chú thích: *: dòng dứa không có gai,
No: không có sản phẩm khuếch đại. A, B, C, D, E: các vị trí của allen.
Qua sự đa hình khác nhau chứng tỏ rằng những primer này có thể sử dụng trong nghiên cứu thiết lập bản đồ phân nhóm của gen qui định tính trạng về hình dạng lá có gai và không có gai trên cây dứa. Đồng thời, kết quả này cũng xác định rằng dòng OMK19 có nguồn gốc từ Tây Ninh thuộc nhóm giống đối chứng Queen. Qua đó, cũng có thể xác định được dòng OMK36 có nguồn gốc từ Kiên Giang là dòng dứa bị phân ly trong quá trình tiến hóa của giống Cayenne bởi bản chất của giống này là không có gai hoặc rất ít nhưng chúng thì có kiểu hình gai và khác nhau về kiểu gen so với những dòng khác trong giống Cayenne. Như vậy, đối với dòng OMK36 cần phải kiểm tra và xác định lại nguồn gốc giống nhằm góp phần phân nhóm giống Cayenne một cách chính xác hơn cũng như tránh nhầm lẫn giống trong lai tạo và chọn lọc. Kết quả khác biệt này cũng sẽ được biểu hiện trong sơ đồ phân nhóm dựa vào phần mềm NTSYS theo phương pháp phân tích nhóm UPGMA .