Máu sau khi đƣợc lấy chuyển nhanh tới phòng thí nghiệm để nuôi cấy. Dùng micro pipette hút môi trƣờng nuôi cấy theo bảng 3.1 vào chai Rough hay ống nghiệm 15 ml tùy theo bố trí thí nghiệm. Sau đó dựng đứng bình, trộn thật nhẹ để môi trƣờng đều.
Trƣớc khi hút máu vào môi trƣờng, phải dựng đứng ống kháng đông từ một đến hai giờ. Vì sau thời gian này, máu sẽ phân tách thành hai lớp. Lớp dƣới là hồng cầu và lớp trên rất nhiều bạch cầu. Sau đó hút lƣợng máu theo kiểu bố trí thí nghiệm vào môi trƣờng nuôi cấy. Chú ý phải lắc nhẹ và đều để máu hòa đều vào môi trƣờng. Thao tác này rất quan trọng vì nó quyết định đến sản phẩm nuôi cấy. Bình nuôi cấy đƣợc chuyển vào tủ ấm CO2 và nuôi cấy ở 370C trong 72 giờ. Đối với chai Rough thì đậy chặt nắp còn đối với ống nghiệm 15 ml thì không đƣợc đậy nắp chặt. Ống 15ml phải đƣợc đặt cố định, nghiêng 300 so với mặt phẳng.
Trong thời gian nuôi cấy phải lắc nhẹ chai Rough và ống nghiệm 15 ml từ một đến hai trong một ngày. Điều này sẽ làm cho hồng cầu lắng xuống đáy và tế bào bạch cầu phân chia nhiều hơn (Kannan và ctv, 2006).
Chai Rough Ống nghiệm 15 ml
Hình 3.2 Nuôi cấy tế bào bạch cầu 3.6.3 Kỹ thuật nhuộm nhiễm sắc thể
3.6.3.1 Kỹ thuật trải đều nhiễm sắc thể
Quy trình nhuộm đƣợc tham khảo theo quy trình của Seabright (1971) Bƣớc 1: Sau khi ủ 72 giờ, cho colcemid vào môi trƣờng nuôi cấy tế bào và đặt vào tủ ấm 20 phút, 40 phút, 60 phút trƣớc khi đem cố định để nhuộm.
Bƣớc 2: Sau khi ủ, chuyển môi trƣờng nuôi cấy vào ống nghiệm 15 ml và ly tâm ở tốc độ 1200 vòng/phút trong 10 phút. Sau đó loại bỏ hầu hết phần nổi, chỉ lấy khoảng 0,5 ml dịch tế bào còn lại.
Bƣớc 3: Trộn đều dịch tế bào trong phần môi trƣờng còn giữ lại và cẩn thận cho thêm 2 ml KCl 0,075 M đã làm ấm trƣớc ở 370C, cho từng giọt một, nếu cho quá nhanh tế bào rất dễ vỡ trƣớc khi đƣợc cố dịnh. Sau đó khi khuấy nhẹ và tiếp tục cho thêm dung dịch KCl cho đến khi thể tích đạt 12ml.
Bƣớc 4: Ủ ống nghiệm 15 phút ở 370C trong water bath.
Bƣớc 5: Cho 1ml dung dịch cố định vào (hỗn hợp 3 methanol : 1 acid axetic) vào và đậy ống ly tâm lại và trộn đều bằng cách đảo ống.
Bƣớc 6: Ly tâm, bỏ nổi nhƣ bƣớc 2.
Bƣớc 7: Tiếp tục thêm 3 ml dung dịch cố định vào và dùng micro pipette để trộn thật đều và mạnh một đến hai phút để các tế bào bạch cầu tách rời ra và dịch tế bào đồng nhất.
Chú ý: bƣớc này rất quan trọng cho chất lƣợng của mẫu. Sau đó thêm dung dịch cố định cho đạt thể tích 10 ml và trộn đều.
Bƣớc 8: Sau đó đem ủ 15 phút ở 40C, ly tâm bỏ nổi nhƣ bƣớc 2.
Bƣớc 9: Lặp lại quá trình cố định ở bƣớc 7 - 8 ba lần nữa. Chỉ trộn nhẹ và không cần ủ lạnh giữa các lần ly tâm. Cuối cùng ta thu đƣợc lƣợng bạch cầu trong 0,5 ml dung dịch cố định.
Bƣớc 10: Sau lần ly tâm cuối cùng, ta thu đƣợc lƣợng bạch cầu trong 0,5 ml dung dịch cố định. Dùng pipette Pasteur hút 50 µl dịch tế bào, đặt pipette vuông góc với phiến kính khoảng cách 60 cm, sau đó nhỏ từng giọt xuống phiến kính. Thao tác này sẽ giúp cho NST sẽ trải đều trên mặt phiến kính. Chú ý: phiến kính phải sạch và phải đặt ở -200C trong 30 phút trƣớc khi sử dụng.
3.6.3.2 Nhuộm nhiễm sắc thể với giemsa
Sau khi trải tế bào trên phiến kính, để phiến kính khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng.
Ngâm phiến kính vào dung dịch nhuộm 15 phút, rữa nhẹ bằng nƣớc sau đó để khô rồi xem dƣới kính hiện vi ở độ phóng đại 1000 lần.
Hình ảnh nhiễm sắc thể đƣợc chụp lại và xử lý trên phần mềm photoshop.
3.7 Xử lý số liệu
Mặc dù bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên một yếu tố, chúng tôi không xử lý thống kê mà nhận định do tỷ lệ thành công còn rất thấp.
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả nhuộm theo thời gian ủ với colcemid
Sau khi nuôi cấy 72 giờ để các tế bào lympho trong máu thỏ đạt giai đoạn trung kỳ, mỗi bình nuôi cấy đƣợc cho thêm 40 µl colcemid (10 µl/ml) và đem ủ ba mức thời gian là 20, 40, 60 phút để chọn ra thời gian ủ tối ƣu nhất. Kết quả nhuộm theo thời gian ủ với colcemid đƣợc trình bày ở bảng 4.1
Bảng 4.1: Số lƣợng tế bào đạt trung kỳ theo thời gian ủ colcemid
Thời gian 20 phút 40 phút 60 phút Số mẫu 10 10 10 Số mẫu thành công 0 2 4 Số phiến kính quan sát 60 60 60 Số phiến kính thành công 0 4 8 Tỷ lệ phiến kính thành công (%) 0 6,66 13,33 Số tế bào thành công 0 6 17
Từ kết quả trên, chúng tôi nhận thấy quá trình ủ mẫu máu nuôi cấy với 40 µl colcemid trong thời gian 20 phút không có mẫu nào thành công, nhƣng khi kéo dài thời gian ủ đến 40 phút có hai mẫu thành công và 60 phút có tới bốn mẫu thành công. Nhƣ vậy, khi ngâm tế bào với colcemid trong thời gian dài hơn thì tỷ lệ mẫu nhuộm sẽ thành công nhiều hơn.
Mỗi mẫu nuôi cấy đƣợc trải đều trên sáu phiến kính. Các phiến kính đƣợc nhuộm với giemsa 8 % và đọc dƣới kính hiển vi có độ phóng đại 1000 lần để quan sát NST ở giai đoạn trung kỳ.
Kết quả cho thấy số lƣợng phiến kính thành công và số tế bào ở giai đoạn trung kỳ khi ủ với colcemid ở thời gian 60 phút là nhiều nhất (8 phiến kính và 17 tế bào thành công). Trong khi đó, khi ủ với colcemid ở thời gian 40 phút số phiến kính thành công chỉ có 4 và số tế bào thành công cũng chỉ có 6.
Nhƣ vậy, khi kéo thời gian ủ colcemid trên tế bào bạch cầu thỏ, thì tác động phá hủy thoi vô sắc của colcemid mạnh hơn, nên số lƣợng tế bào bị phá hủy thoi vô sắc nhiều. Dẫn đến số lƣợng tế bào thu đƣợc ở trung kỳ nhiều hơn.
Trong ba mức ủ thời gian với colcemid 20 phút, 40 phút và 60 phút thì ở 60 phút đều cho kết quả tốt nhất. Nhƣng theo chúng tôi, thời gian nhƣ trên vẫn chƣa tối ƣu cho tế bào máu thỏ, cần khảo sát thêm nồng độ và thời gian ủ colcemid đối với tế bào máu thỏ. Theo Kannan và ctv (2006) khi nuôi cấy bạch cầu máu thỏ, đã ủ colcemid với nồng độ 10 µg/ml trong thời gian 90 phút thu đƣợc rất nhiều tế bào ở trung kỳ. Parkányi và ctv (2004) cũng ủ tế bào với colcemid trong 90 phút nhƣng nồng độ colcemid giảm rất nhiều chỉ có 0,6 µg/ml và tỷ lệ thành công cũng rất cao. Nồng độ và thời gian colcemid thay đổi theo từng loại tế bào, theo kinh nghiệm và hóa chất tại phòng thí nghiệm đó. Nhƣ Sarkar và ctv (1962) khi tiến hành nuôi cấy lớp tế bào giác mạc và tế bào phổi thỏ đã ủ tế bào với colcemid nồng độ 10 µg/ml trong 10 đến 16 giờ, Korstanje và ctv (2003) cũng nuôi cấy tế bào phổi thỏ chỉ với nồng độ colcemid 0,1 µg/ml và thời gian ủ chỉ cũng chỉ 6 giờ cũng đạt đƣợc kết quả rất cao.
4.2 Kết quả nhuộm theo lƣợng máu
Trong quá trình nuôi cấy, thành phần dinh dƣỡng là yếu tố tối quan trọng cho kết quả nuôi cấy. Vì trong nuôi cấy in vtro, tế bào có thể sinh trƣởng và phát triển hay không phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trƣờng. Do đó chúng tôi tiến hành nuôi cấy thử nghiệm lƣợng máu với hai mức độ là 0,4 ml và 1 ml để khảo sát nồng độ dinh dƣỡng cần thiết. Kết quả thu đƣợc trong quá trình nhuộm thể hiện qua bảng 4.2
Bảng 4.2 Kết quả nhuộm theo lƣợng máu nuôi cấy Lƣợng máu 0,4 ml 1 ml Số mẫu 15 15 Số mẫu thành công 3 3 Số phiến kính quan sát 90 90 Số phiến kính thành công 3 9 Tỷ lệ phiến kính thành công (%) 3,33 10 Số tế bào thành công 5 18
Chúng tôi tiến hành nuôi cấy theo hai nồng độ máu khác nhau, kết quả khi nuôi cấy với lƣợng máu 0,4 ml và 1 ml đều có số lƣợng mẫu thành công là ba.
Mỗi mẫu nuôi cấy cũng đƣợc trải đều trên sáu phiến kính, nhuộm màu với giemsa 8 % và xem dƣới kính hiển vi độ phóng đại 1000 lần. Kết quả cho thấy khi nuôi cấy mẫu máu 0,4 ml số phiến kính thành công chỉ có ba, và số tế bào ở trung kỳ cũng rất ít (5 tế bào). Nhƣng tăng lƣợng máu số phiến kính thành công lại tăng lên 9 phiến kính và số lƣợng tế bào thu đƣợc ở trung kỳ là 18.
Trên lý thuyết, khi lƣợng máu ít hơn, các tế bào có thể nhận đƣợc nhiều dinh dƣỡng hơn, giúp cho quá trình phân bào đƣợc tốt hơn. Đặc biệt là mẫu máu đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng RPMI 1640 là môi trƣờng nuôi cấy tốt nhất cho tế bào máu (Kannan và ctv, 2006). Bên cạnh đó, Parkányi và ctv (2004); Kannan và ctv (2006) đã tiến hành nuôi cấy với lƣợng máu chỉ 0,25 ml và 0,3 ml trong 8 ml RPMI 1640 và thu đƣợc rất nhiều tế bào ở trung kỳ. Kết quả của chúng tôi có khác biệt, mẫu máu 1 ml khi nuôi cấy lại cho kết quả tốt hơn mẫu máu 0,4 ml.
Kết quả trên có thể do trong quá trình lấy máu, chúng tôi sử dụng ống có tráng sẵn heparin. Do đó chúng tôi không xác định đƣợc nồng độ heparin thích hợp, nên trong quá trình nuôi cấy máu rất dễ bị đông trở lại.
Vì vậy số lƣợng bạch cầu thu lại trong quá trình nuôi cấy bị mất đi rất nhiều. dẫn đến tỷ lệ thành công khi nuôi cấy 0,4 ml máu thấp hơn nuôi cấy 1ml máu do số lƣợng bạch cầu ít hơn.
Do đó, chúng tôi đã bổ sung thêm heparin vào các ống kháng đông có tráng sẵn heparin và kết quả nuôi cấy máu không bị đông. Chúng tôi thu rất nhiều tế bào bạch cầu trên phiến kính, nhƣng số lƣợng bạch cầu thu đƣợc ở trung kỳ rất thấp. Điều này do chúng tôi không xác định lƣợng heparin thích hợp khi bổ sung vào ống đã tráng sẵn heparin. Vì vậy heparin có thể ảnh hƣởng không tốt đến kết quả nuôi cấy. Theo Eldridge (1985) thì lƣợng kháng đông heparin thích hợp là 14,3 IU/ml máu, trong khi đó Margre và ctv (1992) cho là 10 – 20 IU/ml máu là thích hợp. Một yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả nuôi cấy là do chúng tôi chỉ bổ sung 10% FBS trong môi trƣờng nuôi cấy. Với hàm lƣợng FBS này có lẽ chƣa đủ thích hợp đối với tế bào máu thỏ, điều này làm ảnh hƣởng đến sự phát triển của bạch cầu.
Theo George (1994), Parkányi và ctv (2004); Kannan và ctv (2006), đều nuôi tế bào trong môi trƣờng RPMI 1640 và bổ sung FBS 20 %, và kết quả thu nhiều tế bào ở trung kỳ. Mặt khác, các tác giả khác khi nuôi cấy tế bào để nghiên cứu NST đều dùng chất kích thích phân bào là PHA còn chúng tôi sử dụng Pokeweed. Trên thực tế PHA đƣợc sử dụng phổ biến hơn Pokeweed. So PHA thì khả năng làm lắng tụ hồng cầu cũng nhƣ kích thích tế bào bạch cầu phân chia của Pokeweed yếu hơn (Margre và ctv, 1993). Vì vậy có thể ảnh hƣởng không tốt đến kết quả nuôi cấy.
4.3 Kết quả nuôi cấy thử nghiệm trên ống ly tâm 15ml
Hầu hết tế bào động vật khi phát triển trong in vivo đều bám vào một cấu trúc trong mô liên kết, màng cơ bản hay chất nền khoáng nhƣ xƣơng. Vì vậy khi nuôi cấy tế bào động vật trong in vitro phải sử dụng các bình thủy tinh hay chai Rough có tráng lớp bám dính giúp tế bào phát triển. Nhƣng theo Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc (2006), quá trình nuôi cấy in vitro của tế bào máu không cần lớp bám dính nhƣ những dòng tế bào khác và nó có thể phát triển tốt trong môi trƣờng huyền phù.
Vì thế chúng tôi tiến hành nuôi cấy thử nghiệm trên ống nghiệm 15ml theo quy trình nuôi cấy 1 ml máu trong 72 giờ giống chai Rough. Kết quả thu đƣợc theo bảng 4.3
Bảng 4.3 Kết quả nuôi cấy trên chai Rough và ống nghiệm 15 ml
Thiết bị Chai Rough Ống nghiệm 15 ml
Số lần lập lại 3 3 Thành công 2 2 Số phiến kính quan sát 18 18 Số phiến kính thành công 6 4 Tỷ lệ phiến kính thành công (%) 33,33 22,22 Số tế bào thành công 14 5
Kết quả sau thời gian nuôi cấy và nhuộm, chúng tôi khả năng nuôi cấy thành công ở ống nghiệm 15 ml và chai Rough là nhƣ nhau (số mẫu thành công đều là hai). Khi quan sát thì số phiến kính thành công khi nuôi trên ống nghiệm là 4, còn trên chai Rough là 6. Nhƣng số tế bào thành công ở ống nghiệm 15 ml là rất thấp (5 tế bào ở trung kỳ) so với chai Rough (14 tế bào thành công). Có thể do khi nuôi cấy ở ống 15 ml, thể tích môi trƣờng và máu chiếm 2/3 thể tích bình. Mặc dù trong môi trƣờng đã có Hepes giúp cung cấp lƣợng CO2 và trong quá trình nuôi cấy chúng tôi không đóng chặt nắp và có lắc đều hai lần trong ngày. Nhƣng vì không khí chiếm thể tích là rất thấp (1/3 thể tích) và diện tích mặt phẳng tiếp xúc của tế bào với không khí nhỏ khi nuôi cấy ở ống nghiệm 15 ml so với chai Rough. Điều này có thể làm không ổn định lƣợng khí và pH cần thiết cho tế bào, nên kết quả số lƣợng tế bào thu đƣợc ở ống nghiệm là không nhiều.
Tuy nhiên, kết quả trên là một bƣớc đầu cho việc dùng ống nghiệm 15 ml thay thế cho chai Rough trong nuôi cấy tế bào. Việc ứng dụng ống nghiệm 15 ml trong nuôi cấy tế bào máu sẽ tiết kiệm đƣợc giá thành.
Vì ống nghiệm 15 ml có giá thành rẻ hơn, có thể xử lý dễ dàng cũng nhƣ tái sử dụng lại nhiều lần để nuôi cấy tế bào máu. Ngoài ra, khi nuôi cấy với hàm lƣợng kháng đông nhƣ nhau,máu ở ống 15 ml ít bị đông hơn nuôi cấy trong chai Rough, nên có thể thu đƣợc nhiều bạch cầu hơn. Có thể do lớp bám dính tráng trong lòng của chai Rough làm các hồng cầu khi lắng xuống bám dính lại, dễ gây đông máu.
NST nuôi cấy trên chai Rough NST nuôi cấy trên ống nghiệm 15 ml
Hình 4.1 Nhiễm sắc thể nhuộm với giemsa (X 1000)
Sau khi nhuộm và chụp ảnh lại, dựa trên tỷ lệ chiều dài cánh p và q của NST chúng tôi xác định nhuộm sắc thể thỏ gồm kiểu hình: Metacentric, acrocentric, submetacentric, subtelocentric và telocentric.
Kết quả này giống với các công trình nghiên cứu trƣớc đây nhƣ Robson và Shaver (1979), Parkányi và ctv (2004).
Hình 4.2 Hình dạng nhiễm sắc thể thỏ (X 1000)
Chúng tôi cũng ghi nhận lại đƣợc đặc điểm của chu kỳ phân bào của các tế bào bạch cầu khi quan sát dƣới kính hiển vi. Chúng tôi nhận thấy hầu nhƣ các tế bào đều ở giai đoạn gian kỳ, đặc biệt là khi ủ colcemid ở thời gian 20 phút.
C B D E A A – Metacentric B – Submetacentric C – Subtelocentric D –Telocentric E – Acrocentric
Gian kỳ Tiền kỳ Trung kỳ sớm Trung kỳ Hậu kỳ Mạt kỳ
Hình 4.3 Chu kỳ phân chia của tế bào bạch cầu (X 1000)
4.4 Một số nguyên nhân ảnh hƣởng tới kết nuôi cấy và nhuộm
Chúng tôi chƣa thể xác định đƣợc số lƣợng cũng nhƣ xây dựng kiểu nhân nhiễm sắc thể thỏ vì số tế bào ở giai đoạn trung kỳ rất thấp, và NST chƣa rải đều trên phiến kính. Kết quả nhuộm không tốt có thể do một số yếu tố sau:
a) Thao tác lấy máu
Việc lấy máu ảnh hƣởng khá lớn đến kết quả nuôi cấy. Khi lấy máu ở tim, lƣợng máu lấy đƣợc nhiều và nhanh hơn lấy máu ở động mạch giữa tai. Vì vậy máu nhanh chóng đƣợc hòa tan với chất kháng đông hơn, do đó trong quá trình nuôi cấy mẫu máu ít bị đông hơn so với lấy máu ở động mạch giữa tai. Tuy nhiên việc lấy máu ở tim đòi hỏi ngƣời lấy phải có kinh nghiệm nếu không rất dễ gây chết thỏ.