Trong quá trình thiết lập bộ kit tách chiết DNA, chúng tôi sử dụng cơ vân là nguồn mẫu tách chiết DNA. Để nâng cao tính ứng dụng của bộ kit, chúng tôi sử dụng bộ kit tách chiết DNA sau 3 tháng bảo quản ở 4o
C để tách chiết DNA từ mô máu và da. Hiệu quả tách chiết DNA đƣợc kiểm tra qua phản ứng PCR sử dụng bộ kit PCR halothan.
Đối với mô máu, trong hồng cầu có chứa lƣợng lớn hemoglobin, nguồn DNA chỉ có ở tế bào bạch cầu. Theo Erlich (1989), nhân hem trong hemoglobin là chất ức chế mạnh đến hoạt động của Taq polymerase (trích dẫn bởi Lê Thị Thu Phƣơng, 2004). Do đó, công đoạn đầu tiên trong quá trình tách chiết DNA từ máu là loại bỏ hemoglobin và thu nhận tế bào bạch cầu. Dựa theo qui trình tách chiết DNA từ máu
(theo dẫn liệu của Lê Thị Thu Phƣơng, 2004) và qui trình tách chiết DNA theo bộ kit, chúng tôi xây dựng qui trình tách chiết DNA từ mô máu sử dụng bộ kit.
1. Rã đông hoàn toàn mẫu máu, lấy 500 µl máu vào eppendorf 1,5 ml sau đó cho thêm 400 µl dung dịch E; trộn đều; ly tâm 12000 vòng / phút trong 1 phút, ở 10oC; lấy cặn.
2. Cho vào 500 µl dung dịch E; vortex cho tan cặn; ly tâm 12000 vòng / phút trong 1 phút ở 10oC; lấy cặn.
3. Lặp lại bƣớc 2 đến khi phần cặn trở nên trắng.
4. Cho thêm 60 µl dung dịch A và 3 µl dung dịch D. Ủ hỗn hợp ở 55oC trong 30 phút, sau 10 phút ủ đem vortex 14000 vòng / phút trong 1 phút.
5. Cho vào 200 µl nƣớc cất vô trùng; vortex 14000 vòng / phút trong 30 giây. Thêm 60 µl dung dịch B; vortex 14000 vòng / phút trong 1 phút; ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10o
C.
6. Lấy phần nƣớc nổi bên trên chuyển vào tube 1,5 ml mới, sau đó thêm 500 µl dung dịch C; trộn đều ; ủ -20oC trong 1 giờ.
7. Ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10oC; lấy cặn làm ráo.
8. Rửa cặn bằng 500 µl ethanol 70%, ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10oC, lấy cặn (vừa khô).
9. Làm khô cặn trong tủ ấm ở 55oC, quan sát mức độ khô của cặn (vừa khô). 10. Hòa tan cặn bằng 100 µl dung dịch E; ủ 55oC trong 2 giờ.
Đối với mẫu da, tiến hành ly trích DNA theo qui trình của bộ kit tách chiết DNA.