Từ tháng 03/2007 đến tháng 07/2007.
3.1.2 Địa điểm
Đề tài thực hiện tại các hộ chăn nuơi bị sữa và Cơng ty Cổ Phần Bị Sữa huyện Long Thành, tỉnh Đồng Nai. Mẫu sữa xét nghiệm đƣợc phân tích tại Trung Tâm Phân Tích Trƣờng Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
3.2 Đối tƣợng khảo sát
– 20 con bị sữa Holstein Friesian (HF) nhĩm máu 50 và 75% HF thuộc các lứa 1, 2, 3 và 4 sinh sản bình thƣờng.
– 20 con bị sữa Holstein Friesian (HF) nhĩm máu 50 và 75% HF sau khi sinh từ 90 ngày trở lên thuộc các lứa 1, 2, 3 và 4 khơng động dục hoặc phối giống nhiều lần khơng đậu.
3.3 Nội dung khảo sát
Lấy mẫu sữa của bị đƣợc phân theo nhĩm máu, lứa đẻ ở các ngày thứ nhất lúc gieo tinh; ngày thứ 7, ngày thứ 14, ngày thứ 21 và ngày thứ 24 sau khi gieo tinh để khảo sát hàm lƣợng progesterone trong sữa.
3.4 Phƣơng pháp tiến hành
Khảo sát 20 con bị sữa Holstein Friesian (HF) sinh sản bình thƣờng và 20 con bị sữa chậm động dục hoặc phối nhiều lần khơng đậu theo nhĩm máu 50 và 75% HF thuộc các lứa đẻ 1, 2, 3 và 4.
3.4.1 Bố trí số mẫu sữa khảo sát theo nhĩm máu
Bố trí khảo sát hàm lƣợng progesterone của 80 mẫu sữa trên bị sinh sản bình thƣờng theo nhĩm máu đƣợc trình bày ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1 Số mẫu sữa khảo sát trên bị sinh sản bình thƣờng
Nhĩm máu Số bị (n) Số mẫu sữa thu thập (N)
50% 10 40
75% 10 40
Tổng cộng 20 80
Bố trí khảo sát hàm lƣợng progesterone của 80 mẫu sữa trên bị chậm động dục hoặc phối nhiều lần khơng đậu theo nhĩm máu đƣợc trình bày ở Bảng 3.2
Bảng 3.2 Số mẫu sữa khảo sát trên bị chậm động dục
Nhĩm máu Số bị (n) Số mẫu sữa thu thập (N)
50% 10 40
75% 10 40
Tổng cộng 20 80
3.4.2 Bố trí số mẫu sữa khảo sát theo các lứa đẻ
Bố trí khảo sát hàm lƣợng progesterone của 80 mẫu sữa trên bị sinh sản bình thƣờng theo lứa đẻ đƣợc trình bày ở Bảng 3.3.
Bảng 3.3 Số mẫu sữa khảo sát theo lứa đẻ ở bị sinh sản bình thƣờng
Lứa đẻ Số bị (n) Số mẫu thu thập (N)
1 4 16
2 7 28
3 4 16
4 5 20
Bố trí khảo sát hàm lƣợng progesterone của 80 mẫu sữa trên bị chậm động dục hoặc phối nhiều lần khơng dậu theo lứa đẻ đƣợc trình bày ở Bảng 3.4.
Bảng 3.4 Số mẫu sữa khảo sát theo lứa đẻ ở bị chậm động dục
Lứa đẻ Số bị (n) Số mẫu thu thập (N)
1 4 16
2 7 28
3 4 16
4 5 20
Tổng cộng 20 80
3.4.3 Lấy mẫu sữa và ly tâm 3.4.3.1 Lấy mẫu 3.4.3.1 Lấy mẫu
Vệ sinh lọ đựng sữa cĩ thể tích khoảng 50 ml. Rửa sạch và lau khơ bầu và núm vú của bị sữa. Vắt sữa bị bình thƣờng đƣợc khoảng vài lít, sau đĩ hứng sữa cho vào lọ để đạt thể tích khoảng 50 ml.
Sữa đƣợc lấy vào buổi chiều đối với cả hai nhĩm bị sinh sản bình thƣờng và bị chậm sinh.
3.4.3.2 Ly tâm và trữ mẫu
Mẫu sữa đƣợc ly tâm 3000 vịng/phút. Phần màu vàng đục và đặc ở trên là béo và phần cặn sữa ở dƣới đáy ống nghiệm phải đƣợc loại bỏ. Sử dụng kim chích đâm xuyên qua phần béo rồi hút phần sữa trong bên dƣới cho vào ống đựng mẫu ghi số hiệu và bảo quản trong tủ đơng -300C.
3.4.4 Kỹ thuật ELISA
Chuẩn bị xét nghiệm: Bộ kít progesterone (Bovine progesterone ELISA Test. Endocrine technologies, INC. USA ) đƣợc bảo quản ở 2 đến 80C nếu khơng sử dụng. Tuyệt đối khơng trữ đơng, các mẫu sữa xét nghiệm đƣợc đƣa về nhiệt độ phịng để chuẩn bị pha dung dịch pha lỗng và TBM theo tỷ lệ 1A/1B trong một ống nghiệm sạch trƣớc khi xét nghiệm từ 5 đến 10 phút. Những chất xét nghiệm dƣ phải đƣợc loại bỏ.
3.4.4.1 Thành phần bộ kít
– 96 lỗ giếng đƣợc phủ sẵn kháng thể IgG của thỏ.
– Nồng độ progesterone chuẩn: 0; 0,5; 3,0; 10; 25 và 50 ng/ml chất lỏng pha sẵn, mỗi chai là 0,5 ml.
– Dung dịch pha lỗng mẫu, 25 ml.
– Thuốc thử màu TMB, 12 ml. – Dung dịch chuẩn độ (2N HCL), 6 ml. – Chất đệm rửa 20 X, 20 ml. – Stop Solution (3N HCL): 10 ml. 3.4.4.2 Dụng cụ thực hiện – Máy ly tâm 3000 vịng/phút. – Ống nghiệm bằng nhựa (5 ml). – Bơng thấm nƣớc.
– Thùng đá bảo quản mẫu.
– Pipette chính xác hút đƣợc 25, 50, 100, 200 μl và 1 ml
– Nƣớc cất.
– Ống nghiệm bằng thủy tinh để pha chất nền màu A, B.
– Giấy thấm.
– Băng keo trong.
– Máy đọc đĩa vi chuẩn độ.
– Giấy vẽ đồ thị tuyến tính.
– Tủ sấy 370C.
– Parafine để bịt kín đĩa.
3.4.4.3 Các bƣớc xét nghiệm
– Trƣớc khi xét nghiệm lấy các mẫu sữa ra, để rã đơng ở nhiệt độ phịng rồi mới tiến hành xét nghiệm.
– Tất cả thuốc thử phải đạt tới nhiệt độ phịng 180C đến 250C trƣớc khi sử dụng.
– Lấy pipette chuẩn độ 50 μl hút mẫu vật xét nghiệm và mẫu đối chứng vào các lỗ giếng thích hợp.
– Lấy 100 μl dung dịch kết hợp enzyme progesterone vào mỗi lỗ giếng (ngoại trừ những lỗ giếng để trống, lắc lỗ giếng 30 giây, ủ ở 370C trong 1giờ. Nên dùng parafin để che những lỗ giếng hoặc sử dụng túi thích hợp để cất giữ những đĩa trong suốt quá trình ủ ấm.
– Bỏ những chất cịn tồn đọng bên trong lỗ giếng và rửa đĩa 5 lần với dung dịch rửa (250 đến 300 μl/giếng). Lật ngƣợc đĩa, kiểm tra bằng giấy thấm để lấy đi nƣớc ẩm cịn xĩt lại.
– Thêm 100 μl dung dịch TMB vào tất cả các giếng theo thứ tự.
– Ủ đĩa ở nhiệt độ phịng từ 18 đến 280
C trong 10 phút, khơng đƣợc di chuyển.
– Dừng phản ứng bằng cách cho thêm 50 μl chất chuẩn độ vào các giếng theo thứ tự giống nhau để cơ chất thêm vào tác động từ từ.
– Đọc bƣớc sĩng hấp thu ở 450 nm với máy đọc vi lƣợng.
Chú ý: Ủ cơ chất phải đƣợc giữ trong nhiệt độ từ 25 đến 280
C. Nếu ngồi nhiệt độ giới hạn này, thời gian ủ ấm phải đƣợc tính lại cho đúng.
3.4.4.4 Tính tốn kết quả
– Tính độ hấp thu trung bình mỗi loại: Mẫu chuẩn, mẫu đối chứng, mẫu sữa xét nghiệm.
– Vẽ đƣờng cong chuẩn trên giấy vẽ đồ thị tuyến tính. Độ hấp thu của chuẩn để ở trục tung (Y). Nồng độ chuẩn tƣơng ứng ở trục hồnh (X).
– Tính tốn nồng độ progesterone của mẫu sữa dựa vào đƣờng cong chuẩn trên.
3.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu
– Số liệu đƣợc trình bày dƣới dạng trung bình và sai số của mẫu (X ± SE). – Trung bình cộng: N X ... X X1 2 N X
Trong đĩ: X1, X2, … XN là hàm lƣợng progesterone của mẫu sữa khảo sát N: là số mẫu sữa khảo sát
– Độ lệch chuẩn: SX = 1 - N x ( - i 2 2 ) i x
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Qua thời gian khảo sát hàm lƣợng progesterone trong sữa của 20 bị sinh sản bình thƣờng và 20 bị chậm động dục bằng kỹ thuật ELISA ở các thời điểm lấy mẫu lúc phối giống; 7; 14; 21 và 24 ngày sau khi phối giống, đồng thời sau đĩ 60 ngày khám thai qua trực tràng để chẩn đốn bị đƣợc mang thai hay khơng sau khi phối đã cho các kết quả sau.
4.1 Hàm lƣợng progesterone trong sữa bị sinh sản bình thƣờng
Kết quả khảo sát hàm lƣợng progesterone trung bình trong sữa qua các thời điểm kiểm tra của 20 bị sinh sản bình thƣờng đƣợc trình bày qua Bảng 4.1 và Hình 4.1.
Bảng 4.1 Hàm lƣợng progesterone sữa bị sinh sản bình thƣờng
Hàm lƣợng progesterone
theo nhĩm n
Hàm lƣợng progesterone (ng/ml) của ngày Chẩn đốn mang thai 60 ngày khám qua trực tràng 0 7 14 21 24 n % Cao 10 0,61 0,25 1,08 0,24 1,69 0,42 2,31 0,46 2,55 0,41 8 80 Thấp 10 0,34 0,26 0,58 0,39 1,12 0,43 0,87 0,53 0,80 0,49 0 0
2,55 0,80 0,61 1,08 1,69 2,31 0,34 0,58 1,12 0,87 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 0 7 14 21 24
Ngày lấy mẫu
H àm lư ợn g pr og es te ro ne (n g/ m l) Cao Thấp
Hình 4.1 Hàm lƣợng progesterone sữa bị sinh sản bình thƣờng
Qua khảo sát chúng tơi nhận thấy tỷ lệ đậu thai trên bị sinh sản bình thƣờng là 40%. Kết quả này thấp hơn kết quả tỷ lệ thụ thai của Lê Xuân Cƣơng và ctv (1999) là 68%, Chung Anh Dũng (2002) là 68,4%, Nguyễn Văn Tìm và ctv (1997) là 55,5% - 58,8%. Kết quả nêu trên chứng tỏ cịn nhiều yếu tố hạn chế hiệu quả trong gieo tinh nhân tạo và khả năng thụ thai của bị sữa tại nơi khảo sát.
Qua Bảng 4.1 và Hình 4.1 cho thấy ở nhĩm bị cĩ hàm lƣợng progesterone cao đã cĩ hàm lƣợng progesterone trung bình vào ngày thụ tinh nhân tạo thấp 0,61 ng/ml, tăng nhanh từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 14 lần lƣợt là 1,08 và 1,69 ng/ml và tiếp tục tăng từ ngày thứ 21 đến ngày thứ 24 lần lƣợt là 2,31 và 2,55 ng/ml. Kết hợp với việc kiểm tra hàm lƣợng progesterone ở ngày thứ 21 và 24 và kỹ thuật khám thai qua trực tràng đã cho thấy tỷ lệ đậu thai là 80%. Trong lúc đĩ bằng kỹ thuật khám thai qua trực tràng đã cho thấy hồng thể tồn lƣu là 2 bị chiếm tỷ lệ là 20% trong nhĩm cĩ hàm lƣợng progesterone cao. Kết quả này thấp hơn kết quả của Phan Văn Kiểm và ctv (2006) khi chẩn đốn mang thai sớm bằng ELISA với hàm lƣợng progesterone trung bình trong sữa ở bốn thời điểm tƣơng ứng lần lƣợt là 0,17; 1,45; 2,64 và 2,88 ng/ml và tỷ lệ đậu thai là 84,84% trong nhĩm bị cĩ hàm lƣợng progesterone cao. Điều này cho thấy, bị động dục cĩ rụng trứng, đậu thai, thể vàng
khơng tiêu biến mà vẫn cịn tồn tại làm cho hàm lƣợng progesterone cao trong sữa. Khi khám qua trực tràng chúng tơi nhận thấy bị này cĩ hồng thể to, cứng. Ngồi ra, kết quả khám thai qua trực tràng sau 60 ngày đã cho thấy tỷ lệ này tƣơng đƣơng với khoảng biến thiên so với kết quả khảo sát của Nakao và ctv (1982) khi chẩn đốn mang thai sớm bằng ELISA với độ chính xác biến thiên từ 80 đến 85%. Từ những kết quả mà chúng tơi khảo sát so với kết quả của các tác giả trƣớc đĩ đã cho thấy rằng việc sử dụng kỹ thuật ELISA kiểm tra hàm lƣợng progesterone sữa dễ dàng xác định bị cĩ hàm lƣợng progesterone thấp ở ngày thứ 21 là những bị khơng đậu thai nhƣng đối với những bị cĩ hàm lƣợng progesterone sữa cao đã cho thấy rất khĩ xác định là chúng đã mang thai hay tồn lƣu hồng thể.
Ở nhĩm bị cĩ hàm lƣợng progesterone thấp đã cĩ hàm lƣợng progesterone trung bình ở thời điểm lấy mẫu lúc gieo tinh, 7, 14, 21 và 24 ngày sau khi gieo tinh đều thấp lần lƣợt là 0,34; 0,58; 1,12; 0,87 và 0,80 ng/ml. Ở nhĩm này, bị cĩ động dục, cĩ rụng trứng, thể vàng hình thành, song thể vàng bị tiêu biến. Kết quả này tƣơng đƣơng với kết quả của Phan Văn Kiểm (2006) khi xác định hàm lƣợng progesterone trong sữa bằng kỹ thuật ELISA đối với trƣờng hợp bị khơng mang thai cĩ hàm lƣợng progesterone trung bình lần lƣợt là 0,12; 1,15; 2,48 và 0,25 ng/ml. Ở nhĩm bị này, sau khi gieo tinh hợp tử đƣợc tạo thành nhƣng bị chết. Nguyên nhân hợp tử chết cĩ thể do tử cung bị viêm, rối loạn kích thích tố ví dụ hàm lƣợng LH thấp đã khơng duy trì đƣợc sự phát triển của hồng thể trên bị sau khi phối, nhu cầu dinh dƣỡng chƣa hợp lý, ảnh hƣởng của nhiệt độ, strees, chăm sĩc nuơi dƣỡng chƣa tốt…
Theo Homeida et al (2000), Kamonpatana (1988), Nakao (1981), Bulman (1978) nhận thấy vào ngày động dục hàm lƣợmg progesterone rất thấp là 0,2 ng/ml, sau đĩ tăng dần từ ngày thứ 5 của chu kỳ, đạt đỉnh cao từ ngày thứ 9 đến ngày thứ 18 của chu kỳ, giảm nhanh sau ngày thứ 18, xuống thấp nhất vào ngày thứ 21 của chu kỳ với mức nhỏ hơn 1 ng/ml.
4.1.1 Hàm lƣợng progesterone sữa bị theo nhĩm máu
Kết quả khảo sát hàm lƣợng progesterone trung bình trong sữa qua các thời điểm kiểm tra của bị theo nhĩm máu 50 và 75% HF đƣợc trình bày ở Bảng 4.2 và Hình 4.2, 4.3.
Bảng 4.2 Hàm lƣợng progesterone sữa bị theo nhĩm máu
Nhĩm máu Hàm lƣợng progesterone theo nhĩm n
Hàm lƣợng progesterone (ng/ml) của ngày Chẩn đốn mang thai 60 ngày khám qua trực tràng 0 7 14 21 24 n % 50% Cao 6 0,63 0,25 1,21 0,24 1,90 0,42 2,41 0,58 2,66 0,50 5 83,3 3 Thấp 4 0,26 0,20 0,42 0,35 0,92 0,54 0,82 0,81 0,75 0,76 0 0 75% Cao 4 0,58 0,29 0,90 0,06 1,39 0,14 2,16 0,14 2,39 0,18 3 75 Thấp 6 0,39 0,30 0,69 0,42 1,25 0,32 0,91 0,31 0,83 0,30 0 0 2,66 0,75 2,41 1,90 1,21 0,63 0,82 0,92 0,26 0,42 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 0 7 14 21 24
Ngày lấy mẫu
H àm lư ợn g pr og es te ro ne (n g/ m l) Cao Thấp
Qua Bảng 4.2 và Hình 4.2 cho thấy ở nhĩm bị cĩ hàm lƣợng progesterone cao đã cĩ hàm lƣợng progesterone trung bình vào ngày thụ tinh nhân tạo thấp 0,63 ng/ml, tăng nhanh từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 14 lần lƣợt là 1,21 và 1,90 ng/ml và tiếp tục tăng từ ngày thứ 21 đến ngày thứ 24 lần lƣợt là 2,41 và 2,66 ng/ml. Tỷ lệ khám thai qua trực tràng trong nhĩm bị 50% cĩ hàm lƣợng progesterone cao là 83,33%, kết hợp với việc xác định hàm lƣợng progesterone ở ngày thứ 21 và 24 và kiểm tra thai qua trực tràng cho thấy nhĩm bị này cĩ rụng trứng, thể vàng phát triển tốt.
Ở nhĩm bị cĩ hàm lƣợng progesterone thấp đã cĩ hàm lƣợng progesterone trung bình ở thời điểm lấy mẫu lúc gieo tinh, 7, 14, 21 và 24 ngày sau khi gieo tinh đều thấp lần lƣợt là 0,26; 0,42; 1,92; 0,82 và 0,75 ng/ml. Kết hợp với việc xác định hàm lƣợng progesterone ở ngày thứ 21 và 24 và kiểm tra thai qua trực tràng cho thấy nhĩm bị này buồng trứng khơng rụng trứng, dẫn đến khơng cĩ thể vàng nên hàm lƣợng progesterone thấp. Cĩ thể bị đã động dục nhƣng khơng rụng trứng, hoặc đã động dục, xuất nỗn, gieo tinh, tạo hợp tử nhƣng hợp tử khơng phát triển do tử cung bị viêm làm hợp tử khơng định vị hay dinh dƣỡng kém làm hợp tử khơng phát triển; hoặc rối loạn kích thích tố LH làm hồng thể khơng cịn yếu tố duy trì phát triển, LH tiếp tục phát triển.
2,39 0,83 2,16 0,58 0,90 1,39 0,91 1,25 0,69 0,39 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 0 7 14 21 24
Ngày lấy mẫu
H àm lư ợn g pr og es te ro ne (n g/ m l) Cao Thấp
Qua Bảng 4.2 và Hình 4.3 cho thấy ở nhĩm bị cĩ hàm lƣợng progesterone cao đã cĩ hàm lƣợng progesterone trung bình vào ngày thụ tinh nhân tạo thấp 0,58 ng/ml, tăng nhanh từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 14 lần lƣợt là 0,90 và 1,39 ng/ml và tiếp tục tăng từ ngày thứ 21 đến ngày thứ 24 lần lƣợt là 2,16 và 2,39 ng/ml. Tỷ lệ khám thai qua trực tràng là 75%, kết hợp với việc kiểm tra hàm lƣợng progesterone ở ngày thứ 21 và 24 cho thấy nhĩm bị này cĩ rụng trứng, thể vàng phát triển tốt.
Ở nhĩm bị cĩ hàm lƣợng progesterone thấp đã cĩ hàm lƣợng progesterone trung bình ở thời điểm lấy mẫu lúc gieo tinh, 7, 14 và 21 ngày sau khi gieo tinh đều thấp lần lƣợt là 0,39; 0,69; 1,25; 0,91 và 0,83 ng/ml. Kết hợp với việc kiểm tra hàm lƣợng progesterone ở ngày thứ 21 và 24 cho thấy nhĩm bị này cĩ rụng trứng, thể vàng hình thành và tiết progesterone, song thể vàng bị tiêu biến.
Bảng 4.2 cho thấy, nếu tính trên tổng số bị khảo sát thì thấy ở bị nhĩm máu 50% cĩ tỷ lệ đậu thai là 50% cao hơn so với bị sữa nhĩm máu 75% là 30%. Những kết quả trên là phù hợp với nhận định của Chung Anh Dũng (2002) khi tỷ lệ máu bị