Tiến hành chạy PCR kiểm tra mẫu số 7 với primer của đoạn DNA đó, kiểm tra mẫu số 9 với cặp primer T3, T7.
Hình 4.21 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên plasmid tái tổ hợp.
(1) đối chứng mẫu số 2.1 (sản phẩm PCR từ genome, đoạn DNA insert), (2) sản phẩm PCR plasmid mẫu số 2.1 với cặp primer của chính đoạn gen đó (ITS4, ITS5), (3) leader 100bp, (4) sản phẩm PCR plasmid mẫu số 1.5 với cặp primer T3, T7, (5)đối chứng mẫu số 1.5 (đoạn DNA insert).
Mẫu số 2.1 : Sản phẩm PCR trên genome và trên plasmid có trọng lƣong phân tử băng nhau, chứng tỏ đã chèn đƣơc đoạn DNA kých thƣớc 580bp vào plasmid và biến nạp thành công vào vi khuẩn DH5α.
Mẫu số 1.5 : Sản phẩm PCR trên plasmid có kých thƣớc lớn hơn sản phẩm PCR trên genome, kết quả trên band diện di cho thấy sản phẩm này có kých thƣớc tƣơng đƣơng với tổng kých thƣớc của đoạn DNA chèn và kých thƣớc của vùng poly cloning site trên plasmid. Điều này cho thấy phản ứng nối đã không gây ảnh hƣởng khả năng hoạt động của T3, T7 RNA polymerase promoter. Tuy nhiên, mức độ khuyếch đại của phản ứng này thấp, nguyên nhân có thể do bởi phản ứng PCR chƣa hoàn chỉnh
1 2 3 4 5
580bp
857bp
PHẦN 5 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận
Chúng tôi đã xây dựng đƣợc quy trình chuyển một đoạn DNA bất kỳ vào tế bào chủ DH5α. Quy trình này có thể sử dụng cho các thí nghiệm tạo dòng áp dụng trực tiếp tại phòng thí nghiêm. Các bƣớc chính trong quy trình là
Chuẩn bị khả nạp
Dịch tế bào chuẩn bị để làm khả nạp phải có mật độ tế bào từ 5 x 107 đến 108 và tiến hành theo quy trình sau :
Bƣớc 1: Chuyển bình tam giác chứa dịch nuôi cấy vào thùng nƣớc đá giữ lạnh trong 10 phút.
Bƣớc 2: Hút 1.5ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf 1.5ml, ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 40
C.
Bƣớc 3: Đổ bỏ phần dịch bên trên, thu phần sinh khối kết tủa bên dƣới. Lập lại bƣớc này 3 lần.
Bƣớc 4: Cho 1 ml CaCl2 100mM lạnh vào eppendorf chứa phần sinh khối vừa thu đƣợc. Vortex nhẹ để làm tan hết phần kết tủa.
Bƣớc 5: Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10phút ở 40c
Bƣớc 6: Đổ bỏ phần dịch bên trên, lật ngƣợc eppendorf 1 phút để làm khô kết tủa. Bƣớc 7: Cho 150μl CaCl2 100mM lạnh vào hòa tan phần kết tủa trên.
Thêm 20μl glycerol 98% vào và trữ ở -700 C.
Biến nạp plasmid vào khả nạp
Bƣớc 1: Hút 3µl dịch huyền phù tế bào competen cell đã đƣơc chuẩn bị cho vào eppendorf 1.5 ml, thêm 0.5µl DNA plasmid vào, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá trong 20 phút.
Bƣớc 2: Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 420C, giữ trong 90 giây. Bƣớc 3: Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nƣớc đá, giữ trong 2 phút. Bƣớc 4: Thêm 200µl môi trƣơng LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 370c trong 1 giờ. Bƣớc 5: Hút 150µl dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trƣờng LB có chứa
kháng sinh ampicilyn nồng độ 100μg/ml, X-gal, IPTG, dùng que trang trang đều trên bề mặt môi trƣờng.
Bƣớc 6: Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt. Lật ngƣợc đĩa, ủ qua đêm ở 370C.
Quy trình tách chiết plasmid
Bƣớc 1: Hút dịch vi khuẩn từ mỗi ống cho vào mỗi eppendorf 1.5 ml, ly tâm để thu sinh khối ở 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C.
Bƣớc 2: Hút bỏ dịch bên trên, hút dịch vi khuẩn từ các ống nghiệm tƣơng ứng cho vào, ly tâm 10000 vòng/phút, trong 5 phút ở 200C, lặp lai cho đến khi hết dịch nuôi cấy trong ống nghiệm.
Bƣớc3: Cho 150 ml dung dịch I vào mỗi eppendorf chứa sinh khối, vortex đến khi sinh khối vi khuẩn tan ra hết.
Bƣớc 4: Thêm 200 ml dung dịch II, vortex nhẹ, sau đó thêm tiếp 150 ml dung dịch III, đảo nhe eppendorf.
Bƣớc 5: Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 200C. Thu hết dịch nổi cho vào eppendorf mới tƣơng ứng.
Bƣớc 6: Cho vào mỗi eppendorf chứa dịch nổi vừa mới thu đƣợc 1µl RNAse, ủ ở 370C trong 1 giờ.
Bƣớc 7: Cho vào mỗi eppendorf 300µl phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1) vortex đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C . Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tƣơng ứng.
Bƣớc 8: Cho vào mỗi eppendorf trên 300µl chloroform/isoamylalcohol, lắc đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C. Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tƣơng ứng.
Bƣớc 9: Thêm vào mỗi eppendorf trên 300µl isopropanol, ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 200C. Hút bỏ dịch nổi, thu kết tủa.
Bƣớc 10: Rửa tủa trên bằng cách cho 500µl ethanol 70% lạnh vào mỗi eppendorf, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Hút bỏ dịch nổi, thu lấy kết tủa và làm khô bằng cách úp ngƣợc trên giấy thấm.
Bƣớc 11: Cho 40µl TE vào mỗi eppendorf để hòa tan kết tủa.
Bƣớc 12: Hút 4µl chạy điện di trên agarose nồng độ 0.8% trong 30 phút để xem kết quả chiết tách.
5.2 Đề nghị
Tiếp tục hoàn thiện quy trình theo điều kiện hiện tại của phòng thí nghiệm, chuyển đoạn DNA từ sản phẩm cắt vào tế bào, chuyển một gen hoàn chỉnh vào tế bào chủ và kiểm soát sự biểu hiện của của gen đó.
Nếu trong trƣờng hợp không đủ hoá chất để tách chiết plasmid theo quy trình sử dụng SDS - Kiềm thì nên tách chiết plasmid theo phƣơng pháp xử lý nhiệt gồm các bƣớc sau :
Bƣớc 1: Hút dịch vi khuẩn từ mỗi ống cho vào mỗi eppendorf 1.5 ml, ly tâm để thu sinh khối ở 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200c
Bƣớc 2: Hút bỏ dịch bên trên, hút dịch vi khuẩn từ các ống nghiệm tƣơng ứng cho vào, ly tâm 10000 vòng/phút, trong 5 phút ở 200c, lặp lai cho đến khi hết dịch nuôi cấy trong ống nghiệm.
Bƣớc3: Hoà tan kết tủa trong 500μl TE, vortex để làm tan hết phần kết tủa.
Bƣớc 4: Ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút, hút bỏ dung dịch TE thu lấy kết tủa. Bƣớc 5: Hoà tan kết tủa trong 500 μl dung dịch STET đƣợc làm lạnh .
Bƣớc 6: Thêm 30 – 50 μl dung dịch men lysozyme, vortex làm hoà tan đều. Bƣớc 7: Cho vào bồn nƣớc đƣợc đun sôi trong 1- 2 phút.
Bƣớc 8: Ly tâm 14000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Bƣớc 9: Thu phần dịch nổi bên trên cho vào eppendorf mới.
Bƣớc 10: Thêm 170 – 200 μl dung dịch ammonium acetate 7.5 M và thêm 550μl dung dịch isopropanol. Trộn đều và để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
Bƣớc 11: Ly tâm 14000 vòng/phút trong 15 phút ở 40
C, thu lấy kết tủa.
Bƣớc 12: Thêm 500μl ethanol 70% lạnh vào, ly tâm 14000 vòng/phút trong 15 phút ở 40
C
Bƣớc 13: Loại bỏ dịch nổi thu lấy kết tủa và làm khô ở nhiệt độ phòng. Bƣớc 14: Hoà tan kết tủa trong TE với lƣợng thích hợp.
TÀI LYỆU THAM KHẢO Tài lyệu tiếng việt
1. Bùi Trang Việt, 2002, Bài giảng sinh học phân tử ( chƣơng trình cao học), NXB đại học quốc gia TPHCM.
2. Đinh Duy Kháng, 7-2005, Bài giảng gen cloning và chỉ thị phân tử, Tài lyệu lƣu hành nội bộ trƣờng đại học Nông Lâm TPHCM.
3. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng,2002, Sinh học phân tử, NXB giáo dục.
4. Lê Đình Lƣơng, 2001, Nguyên lý kỹ thuật di truyền, NXB khoa học kỹ thuật 5. Trần Lynh Thƣớc, Đặng Thị Phƣơng Thảo, Nguyễn Đức Hoàng, 2002, Giáo
trình thực tập kỹ thuật di truyền I, NXB Đại học quốc gia TPHCM.
Tài lyệu tiếng nƣớc ngoài.
1. T.A. Brown, 1997, Gen cloning an introduction, third edition, Chapman & Hall.
2. Samuel S.M.Sun, 1994 Method in plant molecular biology and Agricultural biotechnology, A laboratory Training manual, ROC Taiwan.
3. Sambrook and Russell, 1989, Molecular cloning A laboratory manual, Vol I, Vol II, Vol III, CSH.
4. Sambrook J, E. F. Fritsch, T. Maniatis, 1989, Molecular cloning A laboratory manual, second edition, CSH.
5. Wolgang Schumann, 1995, Genetic Enginereering Techniques.
Các website 1. http://faculty.plattsbuggh.edu/donald-slysh/transformation.html 2. 12.http://www.mun.ca/Biochem/course/4103/topic/transrormation.html 3. 13.http://cc.suny.edu/faculty/ 4. 14.http://www.fermentas.com/catalog/kits/kittransformaid.html 5. 15.http://www.kings.edu/Biology/lux/bacterial.html 6. 16.http://fruitfly4.aecom.edu/labmanual/27.html 7. 17.http://core.eai.edu/biol/foruvellm/farwelebpage/Biotech3100/pvector.200.pfd 8. http://lybrary.thinkquest.org/19697/data/ovpc6b.html 9. http://www.web.books.com/mobio/free/ch9a4.html
10.http://www.personal.umd.umich.edu/~mpasson/474/cloning 11.http://www.unn.edu/biology/Bial395-s-05/lab4a.html 12.http://opbs.okstate.edu/~melcher/MG/MGW4/...html 13.http://www.ornl.gov/sci/techresourses/human 14.http://www_biology.ucsd.edu/classes/bimm100.FACO/03cloning.html 15.http://bioprotocol.endlex.com/protocols/lygation.html 16.http://www.soton.ac.uk/~kpa/molecal/clone.html 17.http://wheat.pw.usda.gov/~lazo/methods/lazo/pcr_cloning.html 18.http://brahms.chem.uic.edu/~cgpage/protocol/cloning.html
PHỤ LỤC
Công thức pha một số môi trƣờng dùng trong thí nghiệm
Môi trƣờng LB (Luria – Bertain) lỏng
Trytone 10g
Bacto yeast extract 5g
Natrichlorua (NaCl) 10g
Thêm nƣớc cho tới 1000 ml
Hấp khử trùng ở 1210c trong 20 phút
Môi trƣờng LB agar
Trytone 10g
Bacto yeast extract 5g
Natrichlorua (NaCl) 10g
Agar 15g
Thêm nƣớc cho tới 1000 ml
Hấp khử trùng ở 1210c trong 20 phút.
Môi trƣờng LB + Ampicillyn
Trytone 10g
Bacto yeast extract 5g
Natrichlorua (NaCl) 10g
Agar 15g
Thêm nƣớc cho tới 1000 ml
Hấp khử trùng ở 1210c trong 20 phút, sau đó để nguội đến 40-450c bổ sung Ampicillyn nồng độ cuối 60µg/ml, 100µg/ml
Môi trƣờng LB + Ampicillyn + X-gal + IPTG ( môi trƣờng chọn lọc thể biến nạp E.coly)
Cho 20 µl X-gal (20mg/ml) vào mỗi đĩa petri chứa môi trƣờng LB + Ampicillyn, dùng que trang, trang đều trên đĩa, để cho mặt thạch khô. Thêm tiếp 20µl IPTG (300mg/ml), trang đều trên đĩa và để cho khô mặt thạch
Dung dịch I
Tris – HCl 25mM pH8
Glucose 50mM
EDTA 10mM
Dung dịch II (nên pha trƣớc khi dùng)
Sodium dodecyl sulfat (SDS) 10% 100 µl
NaOH 5N 40µl Nƣớc cất 2 lần 860µl Dung dịch III Glacial acetic 0.2M Potassium acetat 0.2M Dung dịch TE (pH8) Tris – HCl (pH8) 10mM EDTA (pH8) 1mM Dung dịch TAE 1X Tris – acetat 40mM EDTA (pH8) 1mM Loading dye Bromophenol blue 0.25%
Glycerol trong TAE 1X 40%
Dung dịch Lysozyme:
Hoà tan 10mg trong 1ml dung dich Tris-HCl 10mM pH 8.0.
Dung dịch STET (sodium chloride, Tris, EDTA, Triton)
Sucrose 8%
Triton X - 100 0.5%
EDTA pH 8.0 50mM
Tris- HCl pH 8.0 10mM
Dung dịch X-gal 20mg/ml
Cân 20 mg X-gal hoà tan trong 1ml dung dịch dimethylformamide (dung dịch này rất độc, phải cẩn thận khi thao tác)
Cân 20 mg IPTG (dạng bột) hoà tan trong 1 ml nƣớc khử ion, sau đó lọc qua màng lọc có kých thƣớc lỗ 0,2μm
Dung dịch kháng sinh Ampicillyn 100mg/ml
Cân 100mg ampicillyn dạng bột, hoà tan trong 1ml nƣớc khử ion, lọc qua màng lọc có kých thƣớc lỗ 0,45μm. Các loại buffer PCR buffer 10X Tris-HCl pH 8.4 200mM (NH4)2SO4 166mM MgCl2 67mM DTT 100mM NP 40 0,1% Tween-20 0,1%
Buffer SuRE 10X pH 8.0(buffer enzym cắt)
Tris-HCl 100mM
NaCl 1M
MgCl2 50mM
2-Mercaptoethanol 10mM
NEBuffer 1X pH 7.9 (buffer của enzym DNA polymerase I large fragment)
NaCl 50mM Tris-HCl 10mM MgCl2 10mM DTT 1mM Lygation buffer 10X Tris-HCl pH 7.6 660mM MgCl2 66mM DTT 100mM ATP 660μM
MỤC LỤC
Nội dung Trang
Lời cảm ơn ... i
Tóm tắt ...ii
Mục lục ...iii
Danh sách các chữ viết tắt ...vii
Danh sách các hình ...viii
Danh sách các bảng, biểu đồ và sơ đồ ...x
PHẦN 1. MỞ ĐẦU ... 1
1.1 Đặt Vấn Đề ... 1
1.2 Mục tiêu của đề tài ... 2
1.3 Nội dung thực hiện ... 2
1.3.1 Phần 1 ... 2
1.3.2 Phần 2 ... 2
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LYỆU ... 3
2.1 Hiện tƣợng biến nạp ở vi khuẩn... 3
2.1.1 Hiện tƣợng biến nạp ... 3
2.1.2 Vai trò và ứng dụng của biến nạp gen ... 3
2.1.2.1 Vai trò ... 3
2.1.2.2 Ứng dụng ... 3
2.2 Cơ sở sinh hóa và tế bào học của hiên tƣợng biến nạp ... 4
2.3 Sự biến nạp nhân tạo vào tế bào E.coly ... 5
2.3.1 Khái niệm sự biến nạp nhân tạo. ... 5
2.3.2 Sự điều hoà gen của operon Lac ở E.coly ... 5
2.3.3 Chuẩn bị tế bào khả nạp ... 7
2.3.3.1 Phƣơng pháp vật lý ... 7
2.3.3.2 Phƣơng pháp hoá học ... 7
2.3.4 Phƣơng pháp chọn lọc thể biến nạp và plasmid tái tổ hợp ... 8
2.3.5 Chiết tách DNA plasmid ... 9
2.3.6.1 Giới thiệu về phản ứng PCR ... 10
2.3.6.2 Các yếu tố tham gia vào phản ứng PCR ... 10
2.3.7 Điện di DNA ... 14
2.4 Vector, công cụ biến nạp DNA ... 14
2.4.1 Plasmid ... 15
2.4.2 Nhiễm sắc thể virút ... 16
2.5 Các enzym đƣợc sử dụng cho biến nạp DNA ... 16
2.5.1 Các enzym cắt giới hạn ... 16
2.5.2 Các enzym sửa chữa DNA ... 19
2.5.2.1 DNA polymerase I (DNA pol I) ... 19
2.5.2.2 Terminal transferase ... 19
2.5.2.3 Các DNase ... 20
2.5.3 Các enzym khử phosphoril hoá. ... 20
2.5.4 Các enzym nối DNA ... 20
2.5.3.1 E.coly DNA lygase ... 20
2.5.3.2 T4 DNA lygase ... 21
2.6 Thiết kế DNA tái tổ hợp và tăng bội ... 21
2.6.1 Với plasmid ... 21
2.6.2 Với DNA phage ... 21
2.7 Các nghiên cứu lyên quan đến khóa luận ... 21
PHẦN 3: VẬT LYỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 23
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện khoá luận tốt nghiệp ... 23
3.2 Vật lyệu và phƣơng pháp dùng trong thí nghiệm ... 23
3.2.1 Vật lyệu làm thí nghiệm ... 23 3.2.1.1 Vi khuẩn E.coly DH5α ... 23 3.2.1.2 pBluescript II SK(+/-) ... 23 3.2.1.3 Đoạn DNA ... 24 3.2.2 Dụng cụ thí nghiệm ... 24 3.2.3 Các thiết bị máy móc ... 24
3.2.4 Các loại môi trƣơng nuôi cấy vi khuẩn ... 24
3.2.6 Các loại enzym dùng trong thí nghiệm ... 25
3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu ... 26
3.3.1 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn ... 26
3.3.2 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E.coly DH5α và kiểm tra ... 27
3.3.3 Xác định mật số vi khuẩn bằng cách đo OD600nm kết hợp với phƣơng pháp đếm khuẩn lạc ... 28
3.3.3.1 Nguyên tắc ... 28
3.3.3.2 Cách tiến hành ... 28
3.3.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp ... 29
3.3.5 Biến nạp plasmid pBluescript vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt ... 30
3.3.6 Chọn lọc khuẩn lạc mong muốn và tính hiệu suất biến nạp ... 31
3.3.7 Chiết tách plasmid và sử dụng enzym cắt để kiểm tra ... 31
3.3.7.1 Chiết tách plasmid ... 31
3.3.7.2 Phản ứng cắt DNA Plasmid ... 33
3.3.7.3 Quy trình điện di trên gel agarose ... 34
3.3.8 Tinh sạch plasmid và đoạn DNA từ sản phẩm PCR ... 34
3.3.9 Thiết lập phản ứng tạo blunt-end cho sản phẩm PCR ... 35
3.3.10 Thiết lập phản ứng nối giữa plasmid và đoạn DNA đầu bằng (phản ứng nối blunt-end) ... 36
3.3.11 Chuyển sản phẩm nối vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α khả nạp ... 37
3.3.12 Kiểm tra kết quả chiết tách plasmid sử dụng enzym BamHI và Hind III, thực hiện phản ứng PCR plasmid với cặp primers (T3, T7) và (ITS4, ITS5) ... 38
PHẦN 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN ... 39
4.1 Xây dựng đƣờng tƣơng quan tuyến tính ... 39
4.2 Các quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn ... 43
4.2.1 Chọn lọc vi khuẩn biến nạp với nồng độ kháng sinh 60µg/ ml ... 43
4.2.2 Chọn lọc vi khuẩn biến nạp với nồng độ kháng sinh 100µg/ ml ... 45
4.3 Tách chiết DNA plasmid ... 47
4.4 Phản ứng cắt plasmid bằng enzym cắt giới hạn EcoRV ... 50
4.5.1 Tinh sạch đoạn DNA ... 50
4.5.2 Tinh sạch plasmid ... 52
4.6 Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp ... 52
4.7 Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp ... 54
4.8 Kết quả phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp ... 55
4.9 Kết quả kiểm tra bằng kĩ thuật PCR ... 56
PHẦN 5 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ... 58
5.1 Kết luận ... 58
5.2 Đề nghị ... 59
TÀI LYỆU THAM KHẢO ... 61
DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Cấu trúc operon Lac trong vi khuẩn E.coly. ... 6
Hình 2.2 Các chu kỳ của phản ứng PCR. ... 10
Hình 2.3 Mô hình plasmid sử dụng cho cloning ... 15
Hình 2.4 : Hiện tƣợng giới hạn ở vi khuẩn ... 18
Hình 3.1 Phản ứng tạo đầu bằng (blunt-end) cho đoạn DNA. ... 36
Hình 4.1 Kết quả cấy vi khuẩn ở các nồng độ pha loãng khác nhau sau 5, 6 giờ nuôi cấy. ... 39
Hình 4.2 Kết quả cấy vi khuẩn ở các nồng độ pha loãng khác nhau sau 7, 8 giờ nuôi cấy. ... 39
Hình 4.3 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp khi sốc nhiệt 90 giây. ... 43
Hình 4.4 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp khi sốc nhiệt 60 giây. ... 44
Hình 4.5 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp đối chứng. ... 45