Sau khi đã tuyển chọn sơ bộ được 30 chủng có hoạt tính kháng nấm, chúng tôi đã chọn ra 2 chủng có hoạt tính kháng nấm mạnh nhất được ký hiệu là: Đ1 và R2. Ở bước này, các chủng được nuôi lắc trong môi trường dịch thể ISP - 4 để thu dịch nuôi cấy. Kết quả kiểm tra hoạt tính của dịch nuôi cấy theo phương pháp đục lỗ với các chủng nấm như trên được thể hiện trên bảng 3.4 và hình 3.4.
Bảng 3. 4. Hoạt tính kháng nấm của 3 chủng xạ khuẩn Chủng xạ khuẩn Hoạt tính kháng nấm (D- d, mm) CT - 1A CT - 2E CT - 5X Đ1 12 14 15 R2 12 16 17
Kết quả trên bảng 3.4 cho thấy: mặc dù cả 2 chủng xạ khuẩn lựa chọn đều vẫn giữ được hoạt tính kháng nấm, song mức độ kháng đối với các chủng nấm có sự khác nhau. Khả năng kháng nấm CT - 1A của cả 2 chủng xạ khuẩn đều yếu nhất và khả năng kháng chủng CT - 5X của 2 chủng xạ khuẩn là cao nhất.
Chúng tôi tiếp tục tiến hành nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại của 2 chủng xạ khuẩn Đ1 và R2. Hai chủng xạ khuẩn này thuộc hai nhóm màu khác nhau. Chủng Đ1 thuộc nhóm màu trắng và chủng R2 thuộc nhóm màu nâu.
-42-
VSV kiểm định: CT - 5X VSV kiểm định: CT - 2E
Hình 3.4. Hoạt tính kháng nấm của 2 chủng xạ khuẩn lựa chọn 3.3. Đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của 2 chủng XK Đ1 và R2
3.3.1. Đặc điểm hình thái
Chủng R2 có cuống sinh bào tử dạng xoắn, bề mặt bào tử có dạng gai. Chủng Đ1 có cuống sinh bào tử dạng thẳng, bề mặt bào tử xù xì.
Hình 3. 5. Cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử chủng R2
R2 D1
ĐC ĐC
-43-
Hình 3.6. Cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử chủng Đ1
3.3.2.Đặc điểm nuôi cấy
Xạ khuẩn được nuôi cấy trên các môi trường khác nhau để quan sát khả năng sinh trưởng của xạ khuẩn và màu sắc của hệ khuẩn ty. Kết quả cho thấy xạ khuẩn rất đa dạng về màu sắc khi nuôi cấy trên các môi trường khác nhau. Tùy theo thành phần của môi trường nuôi cấy mà màu sắc khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh hay sắc tố hòa tan tiết ra khác nhau. Các đặc điểm nuôi cấy của 2 chủng R2 và Đ1 được trình bày trên bảng 3.5 cho thấy:
Đối với chủng Đ1: khi nuôi cấy trên các môi trường ISP - 1, ISP - 2, ISP - 3, ISP - 5, ISP - 7 màu sắc của KTKS và KTCC đều có màu trắng. Trên môi trường ISP - 4 màu sắc HSCC có màu xám và HSKS có màu trắng. Ở môi trường ISP - 6 màu sắc của HSKS có màu vàng và HSCC có màu trắng.
Đối với chủng R2: màu sắc của HSCC và HSKS có đa dạng hơn khi nuôi cấy trên các môi trường ISP khác nhau.
-44-
Bảng 3. 5:Đặc điểm nuôi cấy của chủng R2 và Đ1 Môi
trƣờng
Chủng Đ1 Chủng R2
HSCC HSKS Sắc tố HSCC HSKS Sắc tố
ISP - 1 Trắng Trắng Không màu Nâu Trắng Không màu
ISP - 2 Trắng Trắng Không màu Nâu Xám ghi Không màu
ISP - 3 Trắng Trắng Không màu Trắng
ngà Xám ghi Không màu
ISP - 4 Xám Trắng Không màu Trắng Xám Không màu
ISP - 5 Trắng Trắng Không màu Trắng
ghi nâu
Trắng
ghi xanh Không màu
ISP - 6 Trắng Vàng Không màu Nâu Xám ghi
(yếu) Melanin
ISP - 7 Trắng Trắng Không màu Nâu Xám ghi Nâu
* Khả năng hình thành sắc tố melanin
Chủng R2 và Đ1 được nuôi cấy trên môi trường ISP - 6 ở nhiệt độ 300C. Sau 14 ngày quan sát chúng tôi nhận thấy:
Hình 3.7. Khả năng hình thành sắc tố melanin của 2 chủng
-45-
Đối với chủng Đ1 màu sắc của môi trường không có sự biến đổi, tức là không có khả năng hình thành sắc tố melanin.
Đối với chủng R2 màu sắc của môi trường biến đổi từ màu vàng nhạt sang màu nâu đậm, điều đó có nghĩa là chủng R2 có khả năng hình thành sắc tố melanin trên môi trường có chứa sắt.
3.3.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa
* Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon
Để đánh giá khả năng đồng hóa các nguồn cacbon khác nhau, chúng tôi tiến hành nuôi 2 chủng R2 và Đ1 trên môi trường ISP - 9 có bổ sung các nguồn cacbon khác nhau với nồng độ 1%. Sau 7 - 14 ngày nuôi cấy, kết quả được thể hiện trên bảng 3. 6.
Bảng 3.6. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của 2 chủng xạ khuẩn Đ1 và R2
Nguồn cacbon Mức độ sinh trƣởng
Chủng Đ1 Chủng R2 Glucose ++++ ++++ Saccharose ++++ ++ Fructose ++++ ++ Lactose - ++++ Manitol ++++ ++++ Dextrin ++ ++++ Cellulose + + Arabinose - +++
Ghi chú: ++++: Sinh trưởng rất tốt; +++: Sinh trưởng tốt;
-46-
Kết quả trên bảng 3.6 cho thấy:
Cả 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu đều có khả năng đồng hóa tốt các nguồn cacbon khác nhau. Song chủng R2 đồng hóa tốt nhất nguồn cacbon là: Glucose, Lactose, Manitol, Dextrin và sinh trưởng yếu nhất trong môi trường có chứa nguồn cacbon Cellulose.
Đối với chủng Đ1 có khả năng đồng hóa tốt nguồn cacbon Glucose, Saccharose, Fructose, Manitol và không có khả năng đồng hóa 2 nguồn cacbon là Lactose, Arabinose.
* Nhiệt độ sinh trưởng thích hợp
Chủng R2 và Đ1 được nuôi ở các thang nhiệt độ khác nhau. Khả năng sinh trưởng của 2 chủng được thể hiện trên bảng 3.7.
Bảng 3. 7: Nhiệt độ sinh trƣởng thích hợp của 2 chủng XK
Nhiệt độ Chủng 25 0 280 300 320 350 400 R2 + +++ +++ ++ + + Đ1 ++ +++ +++ + + -
Ghi chú: +++: Sinh trưởng tốt; ++: Sinh trưởng bình thường; +: Sinh trưởng yếu; -: Không sinh trưởng.
Kết quả trên bảng 3.6 cho thấy, hai chủng R2 và Đ1 có khả năng sinh trưởng trong khoảng nhiệt độ từ 250 - 320C, chủng R2 sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 280 - 300C và sinh trưởng yếu ở nhiệt độ 350 - 400C. Chủng Đ1 cũng sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 280 - 300C và không sinh trưởng ở nhiệt độ 400C. Như vậy nhiệt độ thích hợp cho cả 2 chủng phát triển tốt là 28 - 300C.
* Khả năng chịu muối
Hai chủng R2 và Đ1 được nuôi cấy trong môi trường ISP - 1 có bổ
sung NaCl ở các nồng độ 0,5; 3; 7; 9; 11; 12 và 0% đối chứng. Kết quả thu
được ở bảng 3.8.
-47-
Bảng 3.8:Khả năng chịu muối của 2 chủng R2 và Đ1
Nồng độ NaCl (%) Chủng 0,5 3 5 7 9 12 0 R2 +++ + ++ + + - - Đ1 +++ ++ + + + - -
Ghi chú:+++: Sinh trưởng tốt; ++: Sinh trưởng bình thường; +: Sinh trưởng yếu; -: Không sinh trưởng.
Nồng độ muối có ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của xạ khuẩn. Kết quả trình bày trên bảng 3.8 cho thấy: cả 2 chủng đều có khả năng sử dụng nồng độ muối tới 9% , ở nồng độ muối cao hơn thi cả 2 chủng đều không phát triển được. Như vậy ở nồng độ muối 0,5% chủng xạ khuẩn R2 và Đ1 đều có tác dụng kích thích sự sinh trưởng.
* Khả năng sinh enzym ngoại bào
CMC Casein R2 D1 D1 D1 R2 R2 ĐC ĐC ĐC
-48-
Trong quá trình sống, để phân giải các hợp chất hữu cơ phức tạp thành các hợp chất đơn giản có thể hấp thu được. Xạ khuẩn có khả năng tiết vào môi trường các enzym ngoại bào.
Chúng tôi đã tiến hành kiểm tra khả năng này của 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu, kết quả được thể hiện trên hình 3.8 cho thấy cả 2 chủng xạ khuẩn đều có khả năng thủy phân mạnh casein, tinh bột và CMC.
3.3.4. Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng R2 và Đ1
Hoạt tính kháng sinh của xạ khuẩn cũng là một trong các chỉ tiêu phân loại. Cùng với việc nghiên cứu khả năng kháng nấm gây bệnh trên chè. Chúng tôi cũng kiểm tra khả năng kháng một số chủng nấm kiểm định gây bệnh thực vật như đã nêu trong mục 2.1.1.3. Kết quả được thể hiện trên bảng 3.9 và hình 3.9.
Bảng 3.9: Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng R2 và Đ1 với 3 chủng nấm kiểm định
Chủng xạ khuẩn
Hoạt tính kháng sinh (D - d, mm)
F. oxysporum F. moniliforme R. solani
R2 22 15 17
Đ1 18 19 0
Kết quả trên bảng 3.9 cho thấy: chủng R2 có phổ ức chế các VSV kiểm định khá rộng, có khả năng kháng cả 3 loại nấm. Tuy nhiên chủng R2 có khả năng kháng nấm F. oxysporum là mạnh nhất với vòng ức chế là 22 mm, còn với nấm R. solani là 17 mm và nấm F. moniliforme là 15 mm (hình 3.9).
Chủng Đ1 chỉ có hoạt tính chống nấm F. oxysporum và F. moniliforme mà không có khả năng kháng nấm R. solani.
-49-
Khả năng đối kháng các chủng VSV cùng với các đặc điểm về hình thái, sinh lý, sinh hóa được dùng để tham khảo trong phân loại các chủng xạ khuẩn này.
Từ các kết quả nghiên cứu trên cho thấy 2 chủng xạ khuẩn Đ1 và R2 không chỉ có khả năng kháng nấm gây bệnh trên chè mà cũng có khả năng kháng cả các nấm gây bệnh thực vật như F. oxysporum, F. moniliforme, R.
solani.
VSV kiểm định: F. oxysporum VSV kiểm định: F. monilforme
F. oxysporum F. moniliforme VSV kiểm định: R. solani R. solani. F.oxysporum m D1 D1 D1 R2 R2 R2 ĐC ĐC ĐC
-50-
3.3.5. Vị trí phân loại của hai chủng xạ khuẩn R2 và Đ1
* Phân loại chủng R2
Bảng 3.10. So sánh đặc điểm phân loại của chủng R2 với S. misawaensis
Đặc điểm phân loại Chủng R2 Loài chuẩn
S. misawaensis
Hình thái
Hình dạng cuống
sinh bào tử Xoắn (S) Xoắn (S)
Bề mặt bào tử Có gai ngắn Có gai ngắn
Môi trường ISP - 6
Khả năng sinh
melanin Có Có
Môi trường tinh bột
Màu KTCC Vàng nâu Vàng hoặc vàng
nâu Màu KTKS Xám Xám hoặc xám trắng Sắc tố tan Vàng nhạt Vàng đến vàng nâu Môi trường Czapek Glycerin
KTCC Nâu ghi Nâu ghi
KTKS Trắng hồng Trắng hồng
Sắc tố tan Melanin Melanin
Sinh kháng sinh Có Acwaimycin
Đối chiếuvới khóa phân loại xạ khuẩn của Gause, 1983 [49]. Chúng tôi nhận thấy chủng R2 có nhiều đặc điểm giống với loài S. misawaensis. Kết quả so sánh các đặc điểm của chủng R2 với loài S. misawaensis được trình bày trên bảng 3. 10.
Chủng R2 có cuống sinh bào tử dạng xoắn, bề mặt bào tử có gai ngắn. Khi nuôi cấy trên các môi trường tinh bột màu sắc KTCC từ màu trắng đến
-51-
vàng nâu, còn màu sắc KTKS biến đổi thành màu xám hoặc xám trắng. Trên môi trường Czapek Glycerin màu sắc của KTKS từ màu trắng biến đổi thành màu trắng hồng, còn KTCC biến đổi thành màu nâu ghi. Chủng R2 có khả năng sinh sắc tố melanin trên môi trường có chứa sắt.
Khi so sánh các đặc điểm phân loại của chủng R2 với loài chuẩn S. misawaensis trong khóa phân loại của Gauze, 1983. Chúng tôi nhận thấy chủng R2 có nhiều đặc điểm giống với loài này về hình thái, cuống sinh bào tử, bề mặt bào tử, đặc điểm nuôi cấy, khả năng hình thành sắc tố melanin và CKS.
Như vậy, chủng R2 rất có thể thuộc loài S. misawaensis, nhóm Cinereus, seri: chromogenes. Chủng này được Hamada et Okami, mô tả vào năm 1968c [28].
* Phân loại chủng Đ1
Đặc điểm phân loại của chủng Đ1 được thể hiện trên bảng 3.11 cho thấy: chủng Đ1 có cuống sinh bào tử dạng thẳng, bề mặt bào tử xù xì.
Khi nuôi cấy trên môi trường Gause - I, màu sắc của KTCC từ màu vàng nhạt biến đổi thành màu vàng nâu, màu sắc KTKS có màu trắng. Trên môi trường Gause - II, màu sắc của KTKS từ màu vàng biến đổi thành màu nâu, KTCC không có màu. Trên môi trường Czapek Glucoza, màu sắc của KTCC từ màu trắng biến đổi thành màu nâu vàng, màu của KTKS có màu trắng ánh kem. Chủng Đ1 không có khả năng hình thành sắc tố melanin.
Đối chiếu với khóa phân loại của Gauze, 1983, chúng tôi nhận thấy chủng Đ1 có nhiều đặc điểm giống với loài Actinomyces brunneofungus về các đặc điểm hình thái, cuống sinh bào tử, khả năng hình thành sắc tố melanin và đặc điểm nuôi cấy, khả năng hình thành CKS chống nấm.
-52-
Như vậy, có thể chủng Đ1 thuộc loài A. brunneofungus, nhóm Albus, seri: albocolorabus. Chủng này được Krasilnikov et al, mô tả vào năm 1971[48].
Bảng 3.11. So sánh đặc điểm phân loại của chủng Đ1 với A.brunneofungus
Đặc điểm phân loại Chủng Đ1 Loài chuẩn
A.brunneofungus Hình thái Hình dạng cuống sinh bào tử Thẳng (RF) Thẳng và lượn sóng Bề mặt bào tử Xù xì Xù xì Môi trường ISP - 6 Khả năng sinh
melanin Không Không
Gauze - I
Màu KTCC Vàng nâu Vàng nâu
Màu KTKS Trắng Trắng
Sắc tố tan Không Không có
Gauze - II
Màu KTCC Không màu Không màu
Màu KTKS Nâu Nâu
Sắc tố tan Không Không
Czapek gluco
Màu KTCC Nâu vàng Nâu hoặc nâu
vàng
Màu KTKS Trắng ánh kem Trắng ánh kem
Sắc tố tan Yếu Yếu
Sinh kháng sinh Có Flavofungina
3.4. Khả năng sinh tổng hợp CKS của 2 chủng xạ khuẩn đã lựa chọn 3.4.1. Lựa chọn môi trƣờng lên men thích hợp 3.4.1. Lựa chọn môi trƣờng lên men thích hợp
Trong công nghệ lên men, môi trường lên men đóng vai trò quan trọng. Một môi trường lên men tốt phải là môi trường vừa thuận lợi cho chủng sinh
-53-
trưởng tốt vừa cho hiệu suất kháng sinh cao. Để lựa chọn môi trường lên men đáp ứng được cả hai điều kiện trên, chúng tôi sử dụng 5 loại môi trường lên men cơ sở là: A - 4H, A - 4, Gause - I, Gause - II và ISP - 4.
Quá trình lên men được tiến hành trong bình nón dung tích 250 ml có chứa 25ml môi trường. Sau 120 giờ nuôi lắc ở nhiệt độ 280C - 300C, thu dịch lên men, xác định HTKS bằng phương pháp đục lỗ. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.12 và hình 3. 12
Bảng 3.12: Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng xạ khuẩn trên các môi trƣờng lên men khác nhau
Chủng XK Môi trƣờng Sinh khối (mg/ml) HTKS (D-d,mm)
R2 A - 4H 8,34 ± 0,12 22,33 ± 1,42 A - 4 4,6 ± 0,15 19,52 ± 0,48 Gauze - I 5,51 ± 0,23 17,65 ± 0,58 Gauze - II 7,52 ± 0,21 13,93 ± 0,13 ISP - 4 3,19 ± 0,15 12,18 ± 0,15 Đ1 A - 4H 9,24 ± 0,23 21,34 ± 0,21 A - 4 4,43 ± 0,18 18,72 ± 0,17 Gauze - I 6,48 ± 0,33 16,23 ± 0,44 Gauze - II 7,25 ± 0,22 9,14 ± 0,34 ISP - 4 2,78 ± 0,26 7,25 ± 0,14
-54-
Hình 3.10: Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến khả năng tổng hợp CKS
Kết quả trên bảng 3.12 và hình 3.10 cho thấy: Trong 5 môi trường lên men cả 2 chủng nghiên cứu đều cho sinh khối lớn nhất trong môi trường A - 4H. Với chủng R2 là 8,0 mg/ml, chủng Đ1 là 9,0 mg/ml. Đồng thời dịch lên men của môi trường A - 4H cũng có hoạt tính kháng sinh mạnh nhất (21mm). Từ kết quả này đã chứng tỏ các thành phần trong môi trường lên men có ảnh hưởng nhiều đến khả năng hình thành CKS của xạ khuẩn như nhiều nghiên cứu trước đã khẳng định [14],[17].
Với mục đích là lựa chọn môi trường lên men thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp CKS, căn cứ vào kết quả này chúng tôi nhận thấy môi trường A - 4H là thích hợp nhất và được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.4.2. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon
Các hợp chất cacbon vừa là nguồn dinh dưỡng lại vừa là nguồn cung
cấp năng lượng cho cơ thể. VSV nói chung và xạ khuẩn nói riêng có khả năng
sử dụng được nhiều nguồn cacbon khác nhau.
Để nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh trưởng và hình thành CKS, đồng thời xác định được nguồn cacbon thích hợp nhất cho 2 chủng R2 và Đ1, chúng tôi tiến hành khảo sát một số nguồn cacbon
