Để nghiên cứu ảnh hƣởng của ion kim loại tới hoạt tính của endo-β-1,4-glucanase, dịch enzyme đƣợc ủ với các ion kim loại ở các nồng độ khác nhau là 4; 8 và 12 mM ở nhiệt độ phòng. Sau 4 giờ ủ, hoạt tính còn lại của enzyme đƣợc xác định ở 55°C. Kết quả cho thấy, ở nồng độ 4 mM các ion kim loại và EDTA ảnh hƣởng rất ít tới hoạt tính enzyme. Trong đó, ion K+
làm tăng nhẹ hoạt tính enzyme so với đối chứng (tăng 3%). Các ion kim loại khác và EDTA làm hoạt tính enzyme giảm nhẹ. Trong đó, ion Ag+ làm hoạt tính enzyme giảm hơn cả (giảm 16%). Ở nồng độ 8-12% hoạt tính enzyme vẫn đƣợc duy trì từ 70-99% khi ủ với các ion kim loại. Trừ Fe2+
và Zn2+ làm giảm mạnh hoạt tính enzyme Zn2+ 57%, Fe2+ 58%) (Bảng 3.4 và Bảng 4.18).
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của ion kim loại lên độ bền endo-β-1,4-glucanase
của chủng A. oryzae VTCC-F-045
Ion kim loại (mM) Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase sau 4 giờ ủ (%)
4 8 12 Ag+ 84 99 73 Ca2+ 90 81 73 Co2+ 92 93 92 Cu2+ 96 92 87 EDTA 96 89 71 Fe2+ 87 64 58 K+ 103 86 83 Mn2+ 97 82 77 Ni2+ 95 92 70 Zn2+ 87 62 57
Gao và cs (2008) khi nghiên cứu endo-β-1,4-glucanase từ chủng
A. terreus M11 cho thấy, hoạt tính endo-β-1,4-glucanase giảm mạnh khi ủ với
các ion kim loại Hg2+
, Cu2+; Pb2+ và EDTA ở nồng độ 2,0 mM. Hoạt tính chỉ đạt 77% đối với ion Hg2+
và 59% với ion Cu2+. Trong khi Sr2+, Zn2+ và Mn2+ lại làm tăng hoạt tính của enzyme. Chinedu và cs (2008) nghiên cứu trên chủng P. chrysogemum PCL501 cho thấy ion kim loại Mn2+ và Fe2+ ở nồng độ 2,0 mM làm tăng hoạt tính enzyme so với đối chứng (đạt 320% và 162%). Trong khi Mn2+, Cu2+, Zn2+, Hg2+ và EDTA ức chế mạnh hoạt động của enzyme (đạt 20% với EDTA và 43% với Hg2+
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
1. Chủng A. oryzae VTCC-F-045 có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4- glucanase cao nhất trong số 35 chủng đã đƣợc tuyển chọn. Trình tự đoạn gene 28S rRNA của chủng này (đăng ký trong Genebank: GQ382276) tƣơng đồng 99,7% với chủng thuộc chi Aspergillus trong cây phân loại.
2. Điều kiện để chủng A. oryzae VTCC-F-045 sinh tổng hợp endo-β-1,4- glucanase tối ƣu là: Thời gian 120 giờ; nhiệt độ 28°C; pH ban đầu 5,5; môi trƣờng khoáng MTK với 1% CMC; 0,4% lactose (nguồn carbon) và 1% bột đậu tƣơng (nguồn nitrogen)
3. Qua hai bƣớc tinh sạch bằng tủa ammonium sulfate 65% và cột sắc kí lọc gel Sephadex G-100, endo-β-1,4-glucanase tinh sạch đƣợc có độ sạch so với enzyme thô ban đầu là 2,6 lần và có khối lƣợng phân tử khoảng 36 kDa.
4. Endo-β-1,4-glucanase hoạt động tốt nhất ở pH 5,5 và nhiệt độ 55°C, bền ở 30-45°C và có hoạt tính cao trong pH 6,0. Các dung môi hữu cơ ít ảnh tới endo-β-1,4-glucanase trừ n-butanol. Các chất tẩy rửa (Tween 20, Tween 80, Triton X-100 và SDS), các ion kim loại và EDTA (nồng độ 4-12 mM hầu nhƣ đều làm giảm hoạt tính endo-β-1,4-glucanase.
KIẾN NGHỊ
1. Thử nghiệm lên men lƣợng lớn với nguồn dinh dƣỡng là bột đậu tƣơng, lõi ngô, CMC và thành phần khoáng.
2. Tối ƣu quy trình tách chiết lƣợng lớn endo-β-1,4-glucanase từ môi trƣờng nuôi cấy.
3. Tạo chế phẩm enzyme bổ sung vào thức ăn chăn nuôi gia súc, nâng cao chất lƣợng của vật nuôi.
4. Nghiên cứu cấu trúc gene mã hóa endo-β-1,4-glucanase, tạo endo-β- 1,4-glucanase tái tổ hợp nhằm cải thiện năng suất và có những tính năng phù hợp mong muốn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Lý Kim Bảng, Lê Gia Hy, Tăng Thị Chính, Phan Tuyết Minh, Lê Thanh Xuân, Trần Quang Huy, Đào Ngọc Quang, Phạm Thị Cúc (1999) Sử dụng vi sinh vật có hoạt tính phân giải xenluloza cao để nâng cao chất lƣợng phân hủy rác thải sinh hoạt và nông nghiệp, Báo cáo
khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và
Kỹ thuật, Hà Nội: 546-551.
2. Tăng Thị Chính, Lý Kim Bảng, Lê Gia Hy (1999) Nghiên cứu sản xuất cellulase của một số chủng vi sinh vật ƣa nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 790-797.
3. Cao Cƣờng, Nguyễn Đức Lƣợng (2003) Khảo sát quá trình cảm ứng enzyme chitinaza và celluloza của Trichoderma harzianum ảnh hƣởng của hai enzyme này lên nấm bệnh Sclerotium rolfsic, Báo cáo khoa
học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ
thuật, Hà Nội: 321-324.
4. Vũ Duy Giảng (2009) Sử dụng enzyme để tăng hiệu quả sử dụng năng lƣợng và giảm giá thành thức ăn chăn nuôi, Tạp chí Khoa học Công
nghệ chăn nuôi-Viện chăn nuôi quốc gia: 16.
5. Đặng Minh Hằng (1999) Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của một số chủng vi sinh vật để xử lý rác,
Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa
học và Kỹ thuật, Hà Nội: 333-339.
6. Nguyễn Lan Hƣơng, Hoàng Đình Hòa (2003) Hệ vi khuẩn có hoạt tính thủy phân tinh bột, protein, xenluloza hoặc dầu ô lƣu trong quá trình
phân hủy chất thải hữu cơ, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh
học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 288-291.
7. Nguyễn Lan Hƣơng, Lê Văn Nhƣơng, Hoàng Đình Hoà (1999) Phân lập và hoạt hóa vi sinh vật ƣa nhiệt độ có hoạt tính xenlulaza cao để bổ sung lại vào khối ủ, rút ngắn chu kỳ xử lý rác thải sinh hoạt, Báo cáo
khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và
Kỹ thuật, Hà Nội: 531-536.
8. Trịnh Đình Khá (2006) Tuyển chọn, nuôi cấy chủng vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase và đánh giá tính chất lý hóa của cellulase, Luận văn
thạc sĩ khoa học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc
Gia Hà Nội.
9. Hoàng Quốc Khánh, Ngô Đức Duy, Nguyễn Duy Long (2003) Khả năng sinh tổng hợp và đặc điểm cellulase của Aspergillus niger RNNL- 363, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 304-307.
10.Phạm Thị Ngọc Lan, Phạm Thị Hòa, Lý Kim Bảng (1999) Tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose từ mùn rác, Báo
cáo khoa học, hội nghị viện Công Nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa
học và Kĩ thuật Hà Nội: 177-182.
11.Nguyễn Đức Lƣợng (2003) Sản xuất cà phê theo phƣơng pháp enzyme,
Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa
học và Kỹ thuật, Hà Nội: 318-320.
12.Nguyễn Đức Lƣợng, Đặng Vũ Bích Hạnh (1999) Khả năng sinh tổng hợp cellulase của Actinomyces griseus, Báo khoa học, hội nghị Công
13.Nguyễn Thị Thảo (2005) Tối ƣu các điều kiện nuôi cấy chủng Serratia
sp. DT3 sinh tổng hợp protease ngoại bào và xác định tính chất lý hóa,
Luận văn thạc sỹ sinh học.
14.Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm (2004) Công nghệ enzyme, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
15.Trần Đình Toại, Trần Thị Hồng, Lê Minh Trí, Đỗ Trung Sỹ, Hoàng Thị Bích, Hoàng Thị Hà Giang (2008) Nghiên cứu sử dụng cellulase tách từ
Actinomyces để xử lý phế thải nông nghiệp, Hội nghị khoa học toàn
quốc lần thứ IV, Hội Hóa sinh và Sinh học phân tử phục vụ Nông, Sinh,
Y học và Công nghiệp thực phẩm, Nxb Khoa học và Kỹ thuật: 901-903.
16.Trần Đình Toại, Trần Thị Hồng (2007) Tƣơng lai ứng dụng enzyme trong xử lý phế thải, Tạp chí khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội, Khoa
học Tự nhiên và Công nghệ 23: 75-85.
17.Đỗ Thị Tuyên, Nguyễn Văn Thuật, Quyền Đình Thi (2008) Đánh giá một số tính chất hóa lý của xylanase từ chủng nấm Aspergillus oryzae
DSM1863, Tạp chí Công nghệ sinh học, 6(3): 721-728.
18.Lê Thị Thanh Xuân, Phan Thị Tuyết Minh, Trần Hà Ninh, Tăng Thị Chính (2005) Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn ƣa nhiệt sinh tổng hợp xenllulaza cao, Báo cáo khoa học, Hội nghị toàn quốc,
Nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nxb Khoa học và Kỹ thuật,
Hà Nội: 872-875.
TIẾNG ANH
1. Acharya PB, Acharya DK, Modi HA (2008) Optimization for cellulase production by Aspergillus niger using saw dust as substrate, Afr J
Biotechnol, 7: 4147-4152.
2. Bergquist P, Gibbs M, Morris D, Teo V, Saul D, Morgan H (1999) Molecular diversity of thermophilic cellulolytic and hemicellulolytic bacteria, FEMS Microbiol Ecol 28: 99-110.
3. Bhat KM, Hay AJ, Claeyssens M, Wood TM (1990) Study of the mode of action and site-specificity of the endo-(1-4)-beta-D-glucanases of the fungus Penicillium pinophilum with normal, 1-3H-labelled, reduced and chromogenic cello oligosaccharides, Biochem J, 266: 371-378. 4. Chellapandi P, Himanshu M, Jani (2008) Production of endoglucanase
by the native strains of Steptomyces isolates in submerged fermentation, Brazil Microbiol, 39: 122-127.
5. Chinedu S, Nwinyi C, Okochi V (2008) Properties of endoglucanase of
Penicillium chrysogemum PCL501, Austr Basic Appl Sci, 2(3): 738-
746.
6. Claeyssens M, Tilbeurgh HV, Tomme P, Wood TM, McRae SI (1989) Fungal cellulase systems. Comparison of the specificities of the cellobiohydrolases isolated from Penicillium pinophilum and
Trichoderma reesei,Biochem J, 216: 819-900.
7. Coral G, Burhan A, Unaldi M, Guvenmez H (2002) Some properties of crude carboxymethyl cellulase of Aspergillus nige1r Z10 wild-type strain, Turk J Biol, 26: 209-213.
8. Dahot M, Noomrio M (1996) Microbial production of cellulase by
Aspergillus fumigatus using wheat straw as a carbon source, J Islamic
9. de la Mata I, Estrada P, Macarron R, Dominguez JM, Castillon MP, Acebal C (1992) Chemical mechanism of beta glucosidase from
Trichoderma reesei QM 9414 pH-defrendence of kinetic parameters,
Biochem, 283: 679-682.
10.Fukuda H, Mikami S, Kizaki Y, Wakabayashi S (2002) Properties of cellulose-degrading enzymes from Aspergillus oryzae and their contribution to material utilization and alcohol yield in sake mash fermention, Biosci and Bioeng, 95(5): 479-484.
11.Galagan JE, Calvo SE, Cuomo C, Ma LJ, Wortman, JR, Batzoglou S, Lee SI, Basturkmen M (2005) Sequencing of Aspergillus nidulans and comparative analysis with Aspergillus fumigatus and Aspergillus
oryzae, Nature, 438: 1105-1115.
12.Gao JN, Weng HB, Xi Y, Zhu DH, Han SY (2008) Purification and characterization of a novel endo-β-glucanase from the thermoacidophilic Aspergillus terreus, Biotechnol Lett, 30: 323-327. 13.Gielkens M, Dekkers E, Visser J, Graaff L (1990) Two
cellobiohydrolase-encoding gene from Aspergillus niger require D- xylose and the xylanolytic transriptional activator XlnR for thier expression, Appl Envirion Microbiol, 65: 4340-4345.
14.Gilkes N, Henrissat B, Kilburn D, Miler R, Warren R (1991) Domains in microbial 1,4-glycanases: sequence consveration, function, and enzyme families, Microbial Rev, 55: 303-315.
15.Hara Y, Hinoki Y, Shimoi H, Ito K (2003) Cloning and sequence analysis of endoglucanase genes from an industrial fungus Aspergillus
kawachi, Biosci Biotechnol Biochem, 67: 2010-2013.
16.Henning J, Morkeberg A, Krogh K, Olsson L (2005) Production of cellulases and hemicellulases by three Penicillium species: effect of
substrate and evaluation of cellulase adsorption by capillary elechtrophoresis, Enzyme Microb Tech, 36:42-48.
17.Henrissat B, Claeyssens M, Tomme P, Lemesle L, Mornon J (1989) Cellulase families revealed by hydrophobic cluster analysis, Gene, 81: 83-95.
18.Hong J, Tamoki H, Akiba S, Yamamoto K, Kumajai H (2001) Cloning of a gene encoding a highly stable endo-β-1,4-glucanase from
Aspergillus niger and its expression in yeast, J Biosc and Bioengin, 92:
434-441.
19.Kang M, Rhee Y (1995) Caeboxymethyl cellulases active and stable at alkaline pH from alkalophilic cephalosporium sp. RYM-202,
Biotechnol Lette, 17: 507-512.
20.Kawamori M, Takayama K, Takasawa S (1987) Production of cellulase by a thermophilic fungus, Thermoascus aurantiacus A-131, Agric Biol Chem, 51: 647-654.
21.Khan M, Ali S, Fakhrul-Razi A, Alam Z (2007) Use of fungi for the bioconversion of rice straw into cellulase enzyme, J Environ Sci
Health, 42: 381-386.
22.Kitamoto K (2002) Molecular biology of te Koij molds, Adv in Appl
Microbiol, 51: 129-153.
23.Kitamoto N, Go M, Shibayama T, Kimura T, Kito Y, Ohmiya K, Tsukagoshi N (1996) Molecular cloning, purification and characterization of two endo-1,4-β-glucanases from Aspergillus oryzae
KBN616, Appl Microbiol Biotechnol, 46: 538-544.
24.Lee R, Weimer P, Vanzyl W, Pretorius I (2002) Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnolog, Microbiol Mol Biol Rev, 66: 506-577.
25.Macarron R, Acebal C, Castillon M, Dominguez M, Kata I, Pettersson G, Tomme P, Claeyssenst M (1993) Mode of action of endoglucanase III from Trichoderma reesei, Biochem J, 289: 867-873.
26.Machida M, Asai K, Sano M, Tanaka T, Kumagai T, Terai G, Kusumoto K, Terai G, Kusumoto K, Arima T (2005) Genome sequencing and analysis of Aspergillus oryzae, Nature, 438: 1157- 1161.
27.Milala M, Shehu B, Zanna H, Omosioda V (2009) Degradation of Agaro-Waste by Cellulase from Aspergillus candidus, Asian Journal of
Biotechnology, 1: 51-56.
28.Narasimha G, Sridevi A, Buddolla V, Subhosh CM, Rajsekhar RB (2006) Nutrient effect on production of cellulolytic enzyme by
Aspergillus oryzae, Afr J Biotechnol, 5: 472-476.
29.Nelson N (1944) A photometric adaptation of the Somogyi mehtod for the determination of glucose, J Biol Chem, 153: 375-380.
30.Nozaki K, Seki T, matsui K, Mizuno M, Kanda T, Amano Y (2007) Structure and characteristics of an endo-beta-1,4-glucanase, isolated from Trametes hirsuta, with high degradation to crystalline cellulose,
Biosci Biotechnol Biochem, 71(10): 2375-2382.
31.Ojumu TV, Solomon BO, Betiku EL, Stephen K, Amigun B (2003) Cellulase production by Aspergillus flavus Linn Isolate NSPR 101 fermented in sawdust, bagasse and corncob, Afr Biotechnol, 2: 150-152. 32.Omojasola P, Jilani O (2008) Cellulase production by Trichoderma
longi, Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisae cultured on
waste from orange, Pakistan Biol Sci, 11: 2382-2388.
33.Sandgren M, Guafetti, PJ, Paech, C, Paech S, Shaw A, Gross L, Saldajeno M, Berglund G, Jones T, Mitchinson C (2003) The Humicola
grisea Cel12A enzyme structure at 1.2 Å resolution and the impact of its free cysteine residues on thermal stability, Protein Sci, 12: 2782– 2793.
34.Sang J, Young J, Hyen S (1995) Characterization of a bifunctional cellulase and structural gene. The cel gene of Bacillus sp. D04 has exo- endoglucanase activity, J Biol chem, 270: 26012-26019
35.Tang X, He G, Chen Q, Zhang X, Ali M (2004) Medium optimization for the production of thermal stable beta-glucanase by Bacillus subtilis
ZJF-1A5 using response surface methodology, Bioresour Technol, 93(2): 175-181.
36.Yamane Y, Furita J, Izuwa S, Fukuchi K, Shimizu R, Hiyoshi A (2002) Properties of cellulose-degrading enzymes from Aspergillus oryzae and their contribution to material utilization and alcohol yield in sake mash fermention, Biosci Bioeng, 95(5): 479-484.
PHỤ LỤC
Bảng 4.1. Đƣờng chuẩn glucose
STT glucose (μl ) Đệm natri acetate
pH 5,0 (l) Nồng độ (μg/ml) OD (660nm) 1 10 490 20 0,112 2 15 485 30 0,188 3 20 480 40 0,256 4 25 475 50 0,319 5 30 470 60 0,401 6 40 460 80 0,566
Bảng 4.2. Trình tự nucleotide của đoạn gene 28S rRNA
từ chủng A. oryzae VTCC-F-045
Bảng 4.3. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian Thời gian (giờ) OD (660 nm) Hoạt tính (U/ml) % Lần 1 Lần 2 Trung bình 24 0,42 0,54 0,47 1,96 ± 0,062 101 36 0,46 0,50 0,48 1,99 ± 0,022 103 48 0,45 0,52 0,48 2,00 ± 0,033 104 60 0,37 0,47 0,42 1,73 ± 0,053 90 72 0,39 0,54 0,47 1,93 ± 0,075 100 84 0,40 0,48 0,44 1,81 ± 0,038 94 96 0,26 0,27 0,26 1,09 ± 0,002 56 108 0,36 0,36 0,36 1,49 ± 0,003 77 120 0,66 0,48 0,57 2,35 ± 0,091 122 132 0,28 0,57 0,42 1,75 ± 0,145 90 144 0,33 0,67 0,50 2,08 ± 0,170 107 156 0,22 0,63 0,42 1,76 ± 0,207 91
Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của nồng độ CMC tới khả năng sinh
endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045
Nồng độ CMC (%) OD (660 nm) Hoạt tính (U/ml) % Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB 0,5 0,42 0,39 0,44 0,42 8,52 ± 0,014 100 0,7 0,49 0,48 0,48 0,48 9,86 ± 0,002 116 1,0 0,51 0,59 0,56 0,55 11,27 ± 0,025 132 1,5 0,43 0,41 0,43 0,42 8,58 ± 0,008 101 2,0 0,30 0,31 0,30 0,31 6,21 ± 0,012 73 2,5 0,21 0,22 0,24 0,22 4,53 ± 0,008 53 2,7 0,18 0,16 0,20 0,18 3,66 ± 0,012 43
Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon tới khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045
Nguồn cacbon OD (660 nm) Hoạt tính
(U/ml) % Lần 1 Lần 2 Trung bình Bã mía 0,33 0,38 0,35 0,82 ± 0,028 35 Cao nấm men 0,87 1,12 0,99 2,32 ± 0,124 100 CMC 0,27 0,26 0,26 2,11 ± 0,005 91 Glucose 0,57 0,41 0,49 2,61 ± 0,082 112 Lactose 0,40 0,35 0,38 11,81 ± 0,022 508