Mụ̣t sụ́ thành tựu về đánh giá khả năng chụ́ng chịu và chọn dũng tế

soma bằng kỹ thuọ̃t nuụi cṍy in vitro

Nhƣ̃ng yờ́u tụ́ bṍt lợ i của mụi trƣờng nhƣ nhiợ̀t đụ̣ cƣ̣c đoan (nóng, lạnh), lƣợng mƣa khụng phù hợp (hạn), đụ̣c tụ́ đṍt gõy phèn (nhụm, pH thṍp), mặn (muụ́i NaCl)…là nhƣ̃ng yờ́u tụ́ gõy hạn chờ́ tới năng suṍt cõy trụ̀ng.

Kỹ thuật nuụi cấy mụ và tế bào th ực vật đó đạt đƣợc những thành cụng nhất định trong viợ̀c nghiờn cƣ́u khả năng chụ́ng chịu của cõy trụ̀ng nhƣ : chịu hạn [40], [41], chịu lạnh [5], chịu nhiệt độ cao [48], chịu muối NaCl [29].

Innis M.A., Gelfand D.H.,Sninsky J.J, White T.J (1990) tiờ́n hành gõy mṍt nƣớc mụ sẹo lúa và đã nhọ̃n thṍy ABA là chṍt làm tăng khả năng giƣ̃ nƣớc và chịu mṍt nƣớc của mụ sẹo lúa . Nụ̀ng đụ̣ ABA thích hợp cho viợ̀c tiờ̀n xƣ̉ lý mụ sẹo lúa là 10-5M và thời gian xƣ̉ lý là 5 đến 7 ngày [77].

Bằng kỹ thuọ̃t nuụi cṍy mụ sẹo in vitro, Nguyễn Hoàng Lộc và CS (1992) đã thu đƣợc 4 dũng thuốc lỏ chịu NaCl 1%, cỏc dũng này vẫn duy trỡ khả năng chịu NaCl sau 18 thỏng nuụi cấy trờn mụi trƣờng khụng có NaCl và ở thế hệ thứ nhất (R1) [29].

Lờ Xuõn Đắc (1998), khi xử lý lạnh 2 giống lỳa 71 và TK 90 ở nhiệt độ 10C0,50C đó thu đƣợc một dũng lỳa duy trỡ khả năng chịu lạnh có triển vọng làm giống [5]

Đinh Thị Phòng (2001), Bằng phƣơng pháp thụ̉i khụ mụ sẹo lỳa của cỏc giống lỳa CR 203, CH133, Lụ́c, X11, C70, đã thu đƣợc 271 dũng mụ và 900 dũng cõy xanh có khả năng chịu hạn , tạo thành cỏc quần thể R 0 làm nguyờn liệu cho việc chọn lọc [40].

Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn

Nguyờ̃n Hoàng Lụ̣c (1992) sƣ̉ dụng kỹ thuọ̃t nuụi cṍy mụ sẹo kờ́t hợp với viợ̀c tiờ̀n xƣ̉ lý bằng ABA , manitol và saccharose đã thu đƣợc các dòng mụ thuụ́c lá SC, SC2, SC3 có khả năng chịu mất nƣớc trờn 90% trọng lƣợng tƣơi [29].

Nguyờ̃n Thị Tõm (2004), bằng phƣơng pháp x ử lý mụ sẹo cỏc giống lỳa CR203, CS4, Ml107, 79-1, CN2, ĐH60 ở nhiệt độ cao (400C, 420C) đã tạo ra đƣợc 197 dũng mụ có khả năng chịu nóng và 520 dũng cõy xanh [48].

Nghiờn cƣ́u khả năng chịu hạn ở cõy trụ̀ng nói chung và cõy lúa nói riờng đó và đang đƣợc nhiều tỏc giả quan tõm . Tuy nhiờn viợ̀c ƣ́ng dung kỹ thuọ̃t nuụi cṍy mụ tờ́ bào thƣ̣c vọ̃t trong viợ̀c nghiờn cƣ́u khả năng chịu hạn võ̃n còn nhiờ̀u hạn chờ́ . Trong nhƣ̃ng năm gõ̀n đõy , với sƣ̣ hoàn thiợ̀n vờ̀ kỹ thuọ̃t và điờ̀u kiợ̀n nuụi cṍy đã mở ra nhiờ̀u triờ̉n vọng cho viợ̀c nhiờn cƣ́u khả năng chịu hạn ở các đụ́i tƣợng cõy trụ̀ng khác nhau, trong đó có cõy lúa.

Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn

Chƣơng 2. VẬT LIậ́U VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIấN CƢ́U

2.1. Vật liệu và địa điểm nghiờn cứu 2.1.1. Vật liệu thực vật

Sử dụng 5 giống lỳa sƣu tầm ở Huyện Bắc Quang, tỉnh Hà Giang (Tờn giống lỳa theo tờn địa phƣơng) bao gồm: Ngỏi nỏ, Khẩu tỏn, khẩu mang, Khẩu đen, Shan rõu đƣợc trỡnh bày ở bảng 2.1.

Bảng 2.1. Cỏc giống lỳa cạn sử dụng làm vật liệu nghiờn cứu

Stt Kớ hiệu mẫu Tờn địa phƣơng Địa điểm thu mẫu

1 NN Ngỏi nỏ Bắc Quang - Hà Giang

2 KT Khẩu tỏn Bắc Quang - Hà Giang

3 KM Khẩu mang Bắc Quang - Hà Giang

4 KĐ Khẩu đen Bắc Quang - Hà Giang

5 SR Shan rõu Bắc Quang - Hà Giang

2.1.2. Hóa chất và thiết bị

Hoỏ chất: Hóa chất sử dụng đƣợc mua ở cỏc nƣớc Anh, Đức, Trung Quụ́c... gụ̀m: Ethanol, agarose, Na2HPO4.12H2O, axit citric, NaOH, NaCl, CuSO4, Na2CO3, C4H4O6KNa.4 H2O, thuốc thử foling, petroleum ether, SDS, acrylamide, axit sunfosalysilic, cỏc loại đệm phosphat citrat, tinh bột chuẩn, K3[Fe(CN)6], Fe2(SO4)3, H2SO4,gelatin, 2,4D (Axit Dichlorphenoxyacetic), -NAA (Axit Naphthylacetic), kinetin, cỏc chất khoỏng đa lƣợng , vi lƣợng, vitamin, prolin chuõ̉n, tinh bụ̣t chuõ̉n , toluen, và nhiều hóa chất thụng dụng khỏc.

Thiết bị: Cỏc thiết bị chớnh đƣợc sử dụng để phõn tớch cỏc chỉ tiờu gồm : Mỏy phõn tích axit amin tƣ̣ đụ̣ng – HP aminno Quan SeriesII (Hewlett Parkard), mỏy Quang phổ UVvis Cintra 40 (Australia), bộ điện di protein của hóng Biorad (Mỹ), cõn phõn tớch điện tử (Thụy Sỹ, Anh), mỏy ly tõm lạnh của hóng Hittich (Đức), mỏy đo pH (Metter Toledo), tủ lạnh sõu -850

C, box cấy, nồi khử trựng Tomy (Nhật Bản), tủ sấy, mỏy khuấy trộn Voltex và một số thiết bị thụng dụng khỏc.

Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn

2.1.3. Địa điểm nghiờn cứu

Cỏc chỉ tiờu đƣợc nghiờn cứu và phõn tớch đƣợc thực hiện tại Phũng thớ nghiệm Thƣ̣c vọ̃t học , Di truyền học, Cụng nghệ tế bào và Cụng nghệ gen Khoa Sinh- KTNN, trƣờng Đại học Sƣ phạm- Đại học Thỏi Nguyờn.

2.2. Phƣơng pháp nghiờn cƣ́u

2.2.1. Phƣơng phỏp phõn loại cỏc giống lỳa cạn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Phõn loại lúa nờ́p , lỳa tẻ dựa theo phản ứng bắt màu với dung dịch KI 1% theo Lƣu Ngọc Trỡnh, 1997 [56].

Phõn loại loài phụ dựa theo tỷ lệ dài /rộng và khả năng bắt màu với thuốc thử phenol 10% của vỏ hạt thóc theo phƣơng pháp của Chang (1976) [70].

Đỏnh giỏ cỏc tớnh trạng hỡnh thỏi hạt thóc, đặc điểm chất lƣợng hạt gạo xay theo tiờu chuẩn của IRRI [76].

2.2.2. Phƣơng pháp hó a sinh

2.2.2.1. Phương pháp phõn tích hóa sinh ở giai đoạn hạt tiờ̀m sinh

(1) Xỏc định hàm lượng protein : Hàm lƣợng protein tan đƣợc xỏc định theo phƣơng pháp Lowry đƣợc mụ tả trong tài liợ̀u của Phạm Thị Trõn Chõu và Cs (1997) [3].

Hạt thóc đƣợc bóc vỏ, nghiền mịn, sấy đến khụ tuyệt đối ở 1050

C. Cõn 0,05g mẫu cho vào eppendorf, thờm 1,5 ml đệm chiết phostphat citrat pH=10, lắc đều bằng voltex 10 phỳt, để qua đờm ở nhiệt độ 40

C, đem ly tõm 12000 vũng/phỳt ở 40 C trong 30 phỳt, rụ̀i thu lṍy dịch đờ̉ làm thí nghiợ̀m. Thớ nghiệm lặp lại 3 lõ̀n.

Dịch chiờ́t đƣợc định mức lờn 5ml bằng dung dịch đợ̀m ph osphat citrat (pH=10) và đo phụ̉ hấp thụ trờn mỏy U Vvis Cintra ở bƣớc sóng 750nm với thuốc thử foling.

Hàm lƣợng protein đƣợc tính theo cụng thƣ́c : X (%) = A HSPL

m

 

100 % (2.1) Trong đó: X: hàm lƣợng protein (% khụ́i lƣợng khụ)

Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn

HSPL: hợ̀ sụ́ pha loãng m: khụ́i lƣợng mõ̃u (mg)

(2) Xỏc định hàm lượng đường tan : Hàm lƣợng đƣờng đƣợc xỏc định theo phƣơng phỏp vi phõn tớch đƣợc mụ tả trong tài liệu của Phạm Thị Trõn Chõu và Cs (1997) [3].

Mõ̃u đƣợc bóc vỏ, sṍy khụ tuyợ̀t đụ́i ở 1050

C. Cõn 0,5g mẫu nghiền trong 4ml nƣớc cất. Ly tõm 12000 vũng/phỳt ở 40

C trong 30 phỳt, thu dịch. Hàm lƣợng đƣờng tan đo phụ̉ hṍp thụ ở bƣớc sóng 585 nm. Hàm lƣợng đƣờng tan đƣợc tớnh dựa trờn đụ̀ thị đƣờng chuõ̉n glucose.

Tớnh kết quả tính theo cụng thƣ́c:

X (%) = a b HSPL m

 

(%) (2.2)

Trong đó: X: hàm lƣợng đƣờng tan (% khụ́i lƣợng chṍt khụ) a: mật độ quang đo đƣợc trờn mỏy ở bƣớc súng 585nm

b: số ml dịch chiết HSPL: hệ số pha loóng m: khối lƣợng mẫu (mg)

(3) Phương pháp xác định thành phõ̀n axit amin

Hàm lƣợng axit amin đƣợc xỏc định trờn mỏy HP - Amino Quant sƣ̉ dụng ortho- phtalandehyt tạo dõ̃n xuṍt đụ́i với các axit amin bọ̃c 1 và 9 – fluoreryl- metyl- clorofomat đụ́i với các axit amin bọ̃c 2. Mõ̃u đƣợc xƣ̉ lý theo phƣ ơng pháp thủy phõn pha lỏng theo hƣớng dõ̃n sƣ̉ dụng máy phõn tích axit amin tƣ̣ đụ̣ng.

2.2.2.2. Đánh giá khả năng chịu hạn sinh lý thụng qua phõn tích mụ̣t sụ́ chỉ tiờu sinh hóa ở giai đoạn hạt nảy mõ̀m

(1) Chuõ̉n bị mõ̃u: Hạt của cỏc giống lỳa nghiờn cứu sau khi xử lý nhiệt 350 C trong 10 phỳt, ngõm nƣớc trong 24h sau đó ủ trong dung dịch MS chứa sorbitol 5 %. Hạt nẩy mầm sau cỏc thời gian ủ 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày đƣợc lṍy đờ̉ xác định hoạ t đụ̣ của enzym protease và hàm lƣợng protein tan , hoạt độ của enzym - amylase và hàm lƣợng đƣờng tan. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn

(2) Xỏc định hoạt đụ̣ của enzym - amylase

Xỏc định hoạt độ enzym - amylase theo phƣơng phỏp của Heilken đƣợc mụ tả trong tài liệu của Nguyờ̃n Lõn Dũng (1979) [10].

Hoạt độ enzym - amylase đƣợc xác định dƣ̣a trờn lƣợng tinh bụ̣t bị enzym thủy phõn trong thời gian 30phỳt ở 300

C. Giỏ trị mật độ quang đƣợc đo ở bƣớc sóng 560nm trờn máy quang phụ̉ UVvis Cintra 40.

Nguyờn tắc : Dựa vào tớnh chất hũa tan của enzym - amylase trong dung dịch đệm phosphat 0,2 M pH = 6,8.

Hạt thóc nõ̉y mõ̀m bóc vỏ , cõn khụ́i lƣợng, nghiờ̀n trong đợ̀m phosphat 0,2M pH = 6,8, ly tõm 12000 vũng/phỳt trong 15 phỳt ở 40C, thu dịch đờ̉ xác định hoạt đụ̣ của enzym. Thớ nghiệm phõn tớch hoạt độ enzym - amylase đƣợc tiến hành với ống thớ nghiệm và ống kiểm tra , cơ chất là tinh bột 1% đo trờn máy quang phụ̉ ở bƣớc sóng 560nm. Hoạt độ của enzym - amylase đƣợc tính dƣ̣a trờn đụ̀ thị đƣờng chuõ̉n xõy dƣ̣ng bằng tinh bụ̣t.

Hoạt độ enzym - amylase đƣợc tớnh theo cụng thức:

A (ĐVHĐ/ mg) = (C2 C )1 HSPL h

 

(2.3)

Trong đó: A: hoạt độ enzym - amylase (ĐVHĐ/mg)

C2: lƣợng tinh bụ̣t còn lại của mõ̃u thí nghiợ̀m (mg/ml) C1: lƣợng tinh bụ̣t còn lại của mõ̃u kiờ̉m tra (mg/ml) h: khụ́i lƣợng mõ̃u (mg)

HSPL: hợ̀ sụ́ pha loãng

Định tớnh hoạt đụ̣ enzym - amylase :

Thành phần hỗn hợp dịch: Thạch agar 2%, tinh bột 1% và nƣớc cất. Cho hỗn dịch vào bỡnh tam giác đun cỏch thuỷ cho tan thạch , đổ vào đĩa petri dày 4mm để nguội, đục lỗ đƣờng kớnh 9mm. Nhỏ 100àl dịch chiết chứa enzym vào mỗi lỗ, để tủ lạnh qua đờm để enzym khuyếch tỏn, chuyển sang tủ ấm ở 300

C trong 24giờ. Nhuộm bằng lugol 5phỳt và trỏng lại bằng NaCl 1N.

Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hàm lƣợng đƣờng tan đƣợc xỏc định nhƣ mụ tả ở mục 2.2.2.1

(4) Xỏc định hoạt đụ̣ enzym protease

Hoạt độ enzym protease xác định theo phƣơng pháp Anson theo mụ tả của Nguyờ̃n Văn Mùi (2001) [36].

Hạt thóc nõ̉y mõ̀m bóc vỏ , cõn khụ́i lƣợng , nghiờ̀n trong đợ̀m phosphat (pH=6,5), ly tõm 12000 vũng/phỳt trong 15 phỳt ở 40C, dịch thu đƣợc sử dụng làm thớ nghiệm . Thớ nghiệm phõn tớch hoạt độ enzym protease đƣợc tiến hành với ống thớ nghiệm và ống kiểm tra đo trờn máy quang phụ̉ ở bƣớc sóng 750nm. Hoạt độ của enzym protease đƣợc tính dƣ̣a trờn đụ̀ thị đƣờng chuõ̉n xõy dƣ̣ng bằng tyrozin . Hoạt độ enzym protease tính theo cụng thƣ́c:

(n k) D HSPL ĐVHĐ/ mg T m      (2.4)

Trong đó: n: Chỉ sụ́ đo đƣợc ở bƣớc song 750nm của ống thớ nghiệm (mg/ml) k: Chỉ sụ́ đo đƣợc ở bƣớc song 750nm của ống kiờ̉m tra (mg/ml) D: sụ́ ml dịch chiờ́t

HSPL: hợ̀ sụ́ pha loãng m: khụ́i lƣợng mõ̃u (mg)

T: thời gian ủ enzym với cơ chṍt (phỳt)

Định tớnh hoạt đụ̣ enzym protease: Tiờ́n hành tƣơng tƣ̣ nhƣ định tính hoạt đụ̣ enzym - amylase, cơ chṍt là gelatin 1%.

(5) Xỏc định hàm lượng protein tan

Hàm lƣợng protein tan đƣợc xác định nhƣ mụ tả ở mục 2.2.2.1.

2.2.3. Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn mạ bằng phƣơng pháp gõy hạn nhõn tạo (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Phƣơng pháp đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn mạ đƣợc tiờ́n hành theo Lờ Trõ̀n Bình và Cs (1998) [1].

Hạt lỳa nảy mầm gieo vào cỏc bỏt nhựa nhỏ có kớch thƣớc bằng nhau , mụ̃i hụ̣p 50 hạt. Cỏt vàng đói sạch , phơi khụ cho vào các hụ̣p với lƣợng nhƣ nhau . Thớ nghiợ̀m đƣợc lặp lại 3 lõ̀n cho mụ̃i chỉ tiờu nghiờn cƣ́u trong điờ̀u kiợ̀n chăm sóc nhƣ

Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn

nhau. Thời gian đõ̀u tƣới nƣớc cho đủ õ̉m , khi cõy đƣợc 3 lỏ thật thỡ tiến hành gõy hạn nhõn tạo và đỏnh giỏ khả năng chịu hạn của cỏc giống lỳa . Theo dõi các chỉ tiờu liờn quan đờ́n khả năng chịu hạn trƣớc và sau khi gõy hạn nhƣ sau:

(1) Khụ́i lƣợng tƣơi của rờ̃, thõn lá.

(2) Khụ́i lƣợng khụ của rờ̃ , thõn lá các mõ̃u đƣợc sṍy khụ tuyợ̀t đụ́i ở 1050C đến khi khối lƣợng khụng đổi.

(3) Xỏc định khả năng giữ nƣớc qua cỏc giai đoạ n xƣ̉ lý bởi hạn . Khả năng giƣ̃ nƣớc đƣợc tính theo cụng thƣ́c:

100 (%) x W W W kxl xl  (2.5)

Trong đó: W: khả năng giữ nƣớc của cõy sau khi xử lý hạn (%) Wxl : khụ́i lƣợng tƣơi của cõy sau khi xƣ̉ lý hạn (g) Wkxl : khụ́i lƣợng tƣơi của cõy khụng xử lý hạn (g) (4) Xỏc định chỉ số chịu hạn tƣơng đối của cỏc giống theo cụng thức:

1

S sin (an.bn+bn.cn+ cn.dn +dn.en+...+ kn.an) 2

  (2.6)

Trong đó: S : chỉ số chịu hạn tƣơng đối

: là góc tạo bởi hai trục mang trị số liền nhau  = 3600/9 a,b,c,d….k là các chỉ tiờu theo dõi

n : kớ hiệu cỏc giống nghiờn cứu.

(5) Xỏc định tỷ lệ thiệt hại do hạn gõy ra đƣợc theo cụng thức:

0

n b

TH (%)

nc

 (2.7)

Trong đó: TH: tỷ lệ thiệt hại do hạn gõy ra (%) b: trị số thiệt hại mỗi cấp

n0: sụ́ cõy của mụ̃i cṍp thiợ̀t hại c: trị số thiệt hại của cấp cao nhất n: tụ̉ng sụ́ cõy xƣ̉ lý

Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn

(6) Xỏc định hàm lƣợng prolin

Xỏc định hàm lƣợng prolin theo phƣơng pháp của Bate L.S. và cộng sự (1973) [67].

* Chuẩn bị mẫu: Tiến hành tƣơng tự mục 2.2.3.

* Tiến hành tỏch chiết prolin: Rờ̃, thõn lá của các giụ́ng ở các thời điờ̉m 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày gõy hạn , cõn khụ́i lƣợng 0,3 gram mẫu. Thờm 10ml dịch chiờ́t axit sunfosalisilic 3 %, ly tõm lạnh 7000 vũng/phỳt trong 20 phỳt và lọc qua giấy lọc. Lấy 2ml dịch chiết cho vào bỡnh, bổ sung 2ml axit axetic và 2ml dung dịch ninhidrin, sau đó ủ trong nƣớc nóng 1000C trong 1 giờ, ủ trong tủ đỏ 5 phỳt. Bổ sung vào bỡnh 4ml toluene, lắc đều và lấy phần dịch có màu hồng ở trờn. Đo phổ hṍp thụ ở bƣớc sóng 520nm. Hàm lƣợng prolin đƣợc xỏc định trờn mỏy theo đồ thị chuẩn.

Hàm lƣợng prolin đƣợc tính theo cụng thƣ́c:

(%) AxHSPL 100 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

X x

m

 (2.8)

Trong đó: X: hàm lƣợng prolin (%)

A: nụ̀ng đụ̣ thu đƣợc khi đo trờn máy quang phụ̉ HSPL: hợ̀ sụ́ pha loãng

m: khụ́i lƣợng mõ̃u (mg)

2.2.4. Phƣơng pháp nuụi cṍy in vitro 2.2.4.1. Tạo mụ sẹo từ hạt lỳa

- Khử trùng hạt

Hạt lỳa đƣợc bóc vỏ trấu và khử trựng 1 phỳt trong cồn 700

, 25 phỳt trong nƣớc giaven 60%, lắc nhẹ, rƣ̉a sạch bằng nƣớc cṍt vụ trùng 3 - 5 lõ̀n, sau đó chuyờ̉n hạt lờn đĩa petri có trải giấy lọc vụ trựng.

- Tạo mụ sẹo

Hạt gạo đó khử trựng đƣợc cấy vào mụi trƣờng (MS) cơ bản [42] bụ̉ sung 2mg 2,4D, 3% saccharose, 0,9% agar, pH=5,8. Nuụi 1 tuõ̀n trong tụ́i , 2 tuõ̀n dƣới

Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn

ỏnh sỏng đốn trong phũng nuụi cấy với cƣờng độ 2000lux, thời gian chiờ́u sáng 8/24 giờ, nhiợ̀t đụ̣ 250

C ± 10C.

Đánh giá tỉ lợ̀ tạo mụ sẹo sau 3 tuõ̀n nuụi cṍy của cỏc giống theo cụng thức: Ci (%)=

Ncp

X 100 (2.9) Nt

Trong đó : Ci: Tỷ lệ tạo mụ sẹo (%) Ncp: Số hạt tạo mụ sẹo Nt: Tổng số hạt nuụi cấy

2.2.4.2. Phương pháp xử lý thụ̉i khụ mụ sẹo

Mụ sẹo sau 3 tuõ̀n nuụi đƣợc cắt thành nhƣ̃ng khụ́i mụ có kích thƣớc khoảng 3mm x 3mm. Đặt những khối mụ này lờn đĩa petri có lót giấy vụ trựng và thổi khụ bằng luụ̀ng khí vụ trùng của box cṍy ở các ngƣỡng thời gian khác nhau . Xỏc định đụ̣ mṍt nƣớc của mụ sẹo sau 2, 4, 6 và 8 giờ xƣ̉ lý thụ̉i khụ liờn tục.

Độ mất nƣớc của mụ sẹo sau khi xử lý thổi khụ đƣợc tớnh theo cụng thức: WL (%)=

Wf - Wd

x 100 (2.10) Wf

Trong đó : WL: Độ mất nƣớc (%)

Wf: Khối lƣợng mụ tƣơi (mg)

Wd: Khối lƣợng mụ sau thụ̉i khụ (mg)

2.2.4.3. Chọn lọc mụ sẹo sụ́ng sót sau xử lý và tỏi sinh cõy

Cṍy mụ sẹo sau khi xử lý mất nƣớc lờn mụi trƣờng tỏi sinh cõy (MS cơ bản +