KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Đặc điểm chung của đối tƣợng nghiờn cứu
3.2.3. Phỏt hiện V.cholerae bằng kỹ thuật nuụi cấy
Quỏ trỡnh nhận biết khuẩn lạc và xỏc định rừ vi khuẩn trong quỏ trỡnh nuụi cấy là rất cần thiết, kết quả nghiờn cứu thể hiện ( Bảng 3.7 )
Bảng 3.7. Phần đỏnh giỏ chung trong việc xỏc định cỏc vi khuẩn
Cỏc loại vi sinh vật Nuụi cấy
Số mẫu (+) / 270 mẫu Tỷ lệ (%)
V. cholerae O1 16 5,92
E. coli 47 17,40
N.A.G 4 1,49
Nghiờn cứu của tỏc giả Đinh Sỹ Hiển và cộng sự tại 25 xó của huyện Từ Liờm, Hà Nội với 2.601 mẫu trong 5 năm cho thấy tỷ lệ dương tớnh của cỏc loại vi khuẩn gõy tiờu chảy là 11,54% [11]. Phải chăng V. cholerae xuất hiện khi cỏc căn nguyờn khỏc phỏt triển hay V. cholerae là yếu tố mồi từ đú xuất hiện cỏc căn nguyờn khỏc.
Nghiờn cứu của Lờ Lan Hương và cộng sự (1995) đó nghiờn cứu trờn 121 mẫu phõn bệnh nhõn cú 32 mẫu dương tớnh với một số vi khuẩn gõy tiờu chảy (V.cholerae O1 , Shigella, Salmonella, E. coli ) chiếm tỷ lệ 26,45 % [15], kết quả khảo sỏt của Nguyễn Thị Thế Trõm và cộng sự (1985) tại phường Vĩnh Phước, Nha Trang cho thấy tỷ lệ dương tớnh đối với cỏc vi khuẩn gõy bệnh tiờu chảy là 11,34% [42].
Cũn tại cỏc bệnh viện cú ổ dịch ở khu vực 5 tỉnh Duyờn Hải miền Trung qua kết quả nghiờn cứu của Nguyễn Thị Thế Trõm, Nguyễn Thị Kờ với 5.171 mẫu thu thập cho thấy tỷ lệ dương tớnh với 4 tỏc nhõn gõy bệnh là 24,34% (V. cholerae O1, Shigella, Salmonella, Echerichia coli ) [42].
Đỏnh giỏ nghiờn cứu của chỳng tụi về phõn lập cỏc loại vi khuẩn trong quỏ trỡnh nuụi cấy mẫu phõn ở bệnh nhõn tiờu chảy cấp nghi mắc tả trờn 270 mẫu bệnh phẩm cho thấy đối với chủng V. cholerae O1 cú 16 mẫu dương tớnh, với vi khuẩn E. coli cú 47 mẫu dương tớnh, cỏc phẩy khuẩn khụng phải vi khuẩn tả (N.A.G) cú 4 mẫu, trong nghiờn cứu chỳng tụi cỏc vi khuẩn gõy tiờu chảy cú tỷ lệ phỏt hiện dương tớnh tương đương với cỏc cụng bố của cỏc tỏc giả khỏc. Ngoài ra cú một số loaị vi khuẩn khỏc nhưng vỡ điều kiện và thời gian ngắn nờn chỳng tụi chưa đỏnh giỏ hết được.
Bảng 3.8. Tỷ lệ V. cholerae O1dƣơng tớnh bằng kỹ thuật nuụi cấy
Kết quả Nuụi cấy Tỷ lệ %
Âm tớnh 254 94,07
Dương tớnh 16 5,93
Tổng 270 100
Tỷ lệ V. cholerae O1 phỏt hiện bằng kỹ thuật nuụi cấy cho kết quả 16 mẫu dương tớnh trờn 270 mẫu chiếm tỷ lệ 5,93% ( Bảng 3.8; biểu đồ 3.6 ), kỹ thuật này cho kết quả rất chớnh xỏc nhưng phải qua nhiều bước khỏc nhau, đặc biệt phải cú phũng xột nghiệm vi sinh hợp lý đỳng tiờu chuẩn, đủ mụi trường nuụi cấy, cỏn bộ xột nghiệm phải cú kinh nghiệm phỏn đoỏn để cú cỏc hướng cấy chuyển cần thiết tiếp theo, khõu cuối cựng của kỹ thuật là khẳng định bằng ngưng kết khỏng huyết thanh đa giỏ, đơn giỏ trước khi kết luận.
Tỷ lệ phỏt hiện dương tớnh V.cholerae O1bằng kỹ thuật nuụi cấy
5.93%
94.07%
Âm tớnh Dương tớnh
Biểu đồ 3.6. Tỷ lệ dƣơng tớnh V. cholerae bằng kỹ thuật nuụi cấy
Phương phỏp nuụi cấy được coi là " tiờu chuẩn vàng” tuy nhiờn vẫn cũn mặt hạn chế đú là thời gian trả lời kết quả khẳng định lõu phải mất thời gian từ 24 giờ - 48 giờ và khụng phỏt hiện được V. cholerae khi bệnh nhõn đó dựng khỏng sinh.
Kỹ thuật nuụi cấy đó chọn lọc được khuẩn lạc thuần khiết và đặc hiệu ngoài kinh nghiệm của cỏn bộ xột nghiệm thỡ yếu tố mụi trường nuụi cấy đúng vai trũ rất quan trọng, mụi trường phải đảm bảo chất lượng. Trờn mụi trường thạch kiềm rất tốt cho sự phỏt triển của V. cholerae nhưng ngược lại cỏc loại vi khuẩn khỏc lại khụng phự hợp do vậy tớnh chất mụi trường nuụi cấy phải cú tớnh chọn lọc ức chế loại vi khuẩn này nhưng lại tốt với loại vi khuẩn khỏc.
Mụi trường thạch TCBS ( Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose) là mụi trường chọn lọc tốt nhất để phõn lập V. cholerae và được dựng rộng rói trờn thị trường, mụi trường đó được thương mại hoỏ đụng khụ nờn dễ pha chế, mụi trường cú màu xanh sau khi pha chế nhưng chỉ lưu giữ được một thời gian ngắn (3 - 5 ngày ) những khuẩn lạc mọc trờn mụi trường này khụng thớch hợp cho phản ứng ngưng kết với phản ứng khỏng huyết thanh, khuẩn lạc nghi ngờ mọc sau 12 giờ cú khuẩn lạc trũn, hơi dẹt, búng, màu vàng do lờn men đường
saccharose, những vi khuẩn khụng lờn men saccharose cú khuẩn lạc màu xanh lơ cú thể là V. parahaemolyticus, khuẩn lạc nghi ngờ là V. cholerae cần phải cấy trờn cỏc mụi trường ớt chất ức chế như thạch thường, mụi trường KIA. Chọn những khuẩn lạc nghi ngờ V. cholerae trờn mụi trường TCBS để xỏc định cỏc tớnh chất sinh hoỏ, cỏc tớnh chất sinh hoỏ rất quan trọng để phỏt hiện và phõn biệt V. cholerae. Bảng 3.9. Nhận xột tớnh chất khuẩn lạc trờn mụi trƣờng TCBS Kớch thƣớc khuẩn lạc Màu sắc khuẩn lạc n Tỷ lệ % nhỏ 2-3 mm vàng, búng 67 24,81 nhỏ 1-3 mm khụng màu 203 75,19
Nghiờn cứu của chỳng tụi cho kết quả 67 mẫu cú khuẩn lạc màu vàng trờn mụi trường TCBS chiếm tỷ lệ 24,81 % ( Bảng 3.9 ). Mụi trường TCBS ( Hỡnh 3.7 ) là mụi trường chọn lọc rất tốt trong việc phõn lập V. cholerae tuy nhiờn khuẩn lạc này khụng trực tiếp thực hiện phản ứng Oxidase tiếp theo.
Hỡnh 3.7. Hỡnh ảnh khuẩn lạc V. parahemoliticus và V. cholerae O1
Hỡnh 3.8. Khuẩn lạc V. cholerae trờn mụi trƣờng thạch kiềm
* Nhận xột tớnh chất khuẩn lạc trờn mụi trƣờng thạch kiềm: Là mụi trường thạch thường nhưng cú pH kiềm ( pH = 9 ) thớch hợp cho V. cholerae
phỏt triển, khuẩn lạc V. cholerae nhỏ, trũn, trong, long lanh như hạt sương, cú thể dựng khuẩn lạc này để ngưng kết phản ứng Oxidase.
Bảng 3.10. Nhận xột tớnh chất khuẩn lạc trờn mụi trƣờng thạch kiềm Kớch thƣớc Màu sắc khuẩn n Tỷ lệ
khuẩn lạc lạc % nhỏ 1-3 mm Nhỏ, trong, khụng màu. 62 22,96 nhỏ 1-3 mm Đục, hoặc cú cỏc màu khỏc nhau 218 80,74
Tớnh chất khuẩn lạc trờn mụi trường thạch kiềm ( Hỡnh 3.8 ) cho thấy mụi trường thạch kiềm thớch hợp cho V. cholerae O1 phỏt triển, khuẩn lạc nhỏ, trũn, trong, long lanh như hạt sương, cú thể dựng khuẩn lạc này để ngưng kết phản ứng Oxidase nờn khi tiến hành nghiờn cứu chỳng tụi cấy cả 2 loại mụi trường kết hợp là TCBS và thạch kiềm và luụn ưu tiờn cấy trờn thạch kiềm nhiều hơn vỡ mụi trường này V. cholerae O1 mọc nhanh hơn từ 6-24h đó mọc khuẩn lạc và khuẩn lạc này được dựng để thực hiện phản ứng Oxidase và cỏc bước tiếp theo. Trong khi đú trờn mụi trường TCBS thời gian mọc khuẩn lạc muộn hơn so khuẩn lạc mọc trờn mụi trường thạch kiềm, nhưng khi mọc đó bổ sung cho nhau về ưu điểm của mỗi loại mụi trường, trong kết quả nghiờn cứu của chỳng tụi cho 62 mẫu quan sỏt khuẩn lạc nhỏ trong khụng màu chiếm tỷ lệ 22,96 % ( Bảng 3.10 )
* Thời gian mọc khuẩn lạc trờn 2 loại mụi trƣờng nuụi cấy
Thời gian mọc khuẩn lạc đúng vai trũ quan trọng trong nuụi cấy chẩn đoỏn nhanh V. cholerae O1. Như đó đề cập trong phần tổng quan, nếu cú điều kiện nờn cấy trờn cả 2 loại mụi trường là TCBS và thạch kiềm, đặc biệt trờn
mụi trường thạch kiềm sau 6 giờ khuẩn lạc đó mọc sẽ được dựng trong phản ứng Oxidase và ngưng kết khỏng huyết thanh.
Bảng 3.11. Thời gian mọc khuẩn lạc trờn 2 loại mụi trƣờng nuụi cấy
Theo dừi thời gian mọc khuẩn lạc trờn mụi trường TCBS và mụi trường thạch kiềm chỳng tụi nhận thấy trờn mụi trường thạch kiềm khuẩn lạc mọc 6 giờ sau khi cấy cú 21 mẫu mọc chiếm tỷ lệ 7,78 % trong khi đú trờn mụi trường TCBS chưa cú khuẩn lạc nào mọc ( Bảng 3.11 ). Trong phần phương phỏp nghiờn cứu chỳng tụi đó đề cập với thời gian mọc khuẩn lạc trờn 2 mụi trường khụng giống nhau nhưng cú ý nghĩa rất quan trọng cho việc khảng định tớnh chất sinh húa sau này.
Khuẩn lạc nghi ngờ là V. cholerae được định hướng dựa vào tớnh chất sinh vật húa học để phõn biệt được cỏc vi khuẩn thuộc nhúm vi khuẩn đường ruột bằng cỏch chọn những khuẩn lạc nghi ngờ V. cholerae trờn mụi trường TCBS để xỏc định cỏc tớnh chất sinh hoỏ. Cỏc tớnh chất sinh hoỏ rất quan trọng để phỏt hiện và phõn biệt cỏc loài V. cholerae, đỏnh giỏ tớnh chất sinh vật húa học chỳng tụi chọn 31 mẫu cú phản ứng Oxidase dương tớnh để thực hiện nuụi cấy tiếp trờn mụi trường sinh vật húa học.
Mụi trƣờng Thời gian mọc khuẩn lạc
n Tỷ lệ % %
Mụi trường TCBS < 6h 0/270 0
Hỡnh 3.9. Cỏc mụi trƣờng sinh vật húa học trong chẩn đoỏn V. cholerae
Bảng 3.12. Bảng đọc kết quả trờn mụi trƣờng sinh vật hoỏ học
Kết quả thực hiện trờn mụi trường sinh vật húa học với 24 mẫu glucoza dương tớnh, 21 mẫu õm tớnh đường lactoza, trờn mụi trường ma nit cú 27 mẫu dương tớnh và 23 mẫu quan sỏt đường cấy thấy di động, mụi trường Indol cú 2 mẫu dương tớnh, đặc biệt trong 3 loại đường thỡ Arabinoza cú 21 mẫu õm tớnh, mannoza cú 20 mẫu dương tớnh, saccaroza cú 20 mẫu dương tớnh (Bảng 3.12 )
Tớnh chất sinh vật húa học cú thể phõn biệt được cỏc vi khuẩn thuộc nhúm vi khuẩn đường ruột, tuy nhiờn để rỳt ngắn quỏ trỡnh chẩn đoỏn ta cần
STT Sinh vật húa học Tiờu chuẩn đỏnh giỏ dƣơng tớnh Kết quả 1 Oxidaza + 31 2 Glucoza / H2S + / + 24 / 23 3 Lactoza - 21 4 Manit + 27 5 Di động + 23 6 urờ - 22 7 Indol + 21 8 Arabinoza - 21 9 Mannoza + 20 10 Saccaroza + 21
dựng một số đặc điểm chớnh để phõn biệt (loại trừ ngay cỏc vi khuẩn õm tớnh với oxidase ).
* Nhận biết phản ứng dƣơng tớnh Oxidase
Khuẩn lạc trờn mụi trường khụng chọn lọc được dựng để thực hiện phản ứng Oxidase, đõy là phản ứng rất quan trọng để phõn biệt V. cholerae với cỏc vi khuẩn đường ruột khỏc, V. cholerae cú phản ứng oxidase (+). Cỏch tiến hành đơn giản khi cú khuẩn lạc mọc trờn mụi trường thạch kiềm bằng cỏch nhỏ một giọt dung dịch Oxidase lờn mảnh giấy lọc, dựng que cấy lấy khuẩn lạc từ ống thạch nghiờng dàn đều trờn giấy lọc đó thấm thuốc thử, quan sỏt sự đổi màu trong vài phỳt, cú thể coi phản ứng Oxidase như chỡa khúa để chẩn đoỏn vi khuẩn tả vỡ nếu õm tớnh thỡ sẽ loại tỡm theo hướng khỏc, nếu phản ứng dương tớnh sẽ thực hiện cỏc bước để chẩn đoỏn vi khuẩn tả.
Để rỳt ngắn quỏ trỡnh chẩn đoỏn chỳng tụi đó thực hiện một số đặc điểm chớnh để phõn biệt bằng thử phản ứng Oxidase bằng cỏch nhỏ một giọt dung dịch Oxidase lờn mảnh giấy lọc, dựng que cấy lấy khuẩn lạc từ ống thạch nghiờng dàn đều trờn giấy lọc đó thấm thuốc thử, quan sỏt sự đổi màu trong vài phỳt kết quả thể hiện ở ( Hỡnh 3.10 )
Bảng 3.13. Phản ứng Oxidase
Kết quả Oxidase Tỷ lệ %
Âm tớnh 239 88,52
Tổng cộng 270 100
V. cholerae cú phản ứng Oxidase (+), khụng nờn lấy khuẩn lạc trực tiếp từ mụi trường TCBS để làm phản ứng Oxydase từ đú cú thể cho kết quả khụng chớnh xỏc mà nờn cấy chuyển khuẩn lạc nghi ngờ từ mụi trường TCBS sang mụi trường khụng chọn lọc như thạch thường hoặc thạch mỏu rồi từ đú tiếp tục làm phản ứng Oxidase.
Kết quả nghiờn cứu chỳng tụi cho thấy cú 31 mẫu dương tớnh với phản ứng Oxidase chiếm tỷ lệ 11,48 % ( Bảng 3.13), nếu so kỹ thuật soi tươi phỏt hiện mẫu nghi ngờ dương tớnh V. cholerae O1 là 28 mẫu chiếm tỷ lệ 10,37 %. Vấn đề đặt ra trong thực tế nếu cỏc phũng thớ nghiệm chưa hoàn chỉnh để thực hiện cỏc bước nuụi cấy thỡ cú thể ỏp dụng cấy bệnh phẩm từ mụi trường tăng sinh vào mụi trường thạch kiềm sau 6 giờ ta cú thể chọn khuẩn lạc thực hiện phản ứng Oxidase.
Hỡnh 3.10. Hỡnh ảnh phản ứng Oxidase
* Nhận biết vi khuẩn mọc trờn mụi trƣờng pepton kiềm
Mụi trường pepton kiềm được dựng để vận chuyển V. cholerae trong một thời gian ngắn nếu khụng cú mụi trường Carry – Blair. Khụng thể dựng được lõu nếu việc vận chuyển chậm quỏ 6 giờ vỡ cỏc vi khuẩn khỏc như
sinh nờn được cấy chuyển liờn tiếp 3 lần, mỗi lần 3 giờ ở nhiệt độ 370C. Đõy là mụi trường tăng sinh tốt nhất cho sự phỏt triển V. cholerae, vỡ vi khuẩn này mọc rất nhanh trong pepton kiềm do pH của nú rất thớch hợp (pH 8,4-9,2). Khi xột nghiệm mẫu thực phẩm hoặc mẫu nước tỡm V. cholerae trong vụ dịch tả người ta thường dựng hai bước tăng sinh bằng pepton kiềm, bước tăng sinh thứ hai nhằm loại bớt cỏc tạp khuẩn, hơn nữa người ta cũn dựng mụi trường Monsur tellurit-taurocholat để tăng sinh vỡ mụi trường này cú nhiều chất ức chế hơn.
Theo dừi tớnh chất mọc của V. cholerae trờn mụi trường pepton kiềm (mụi trường tăng sinh) chỳng tụi cú một số nhận xột về tớnh chất mọc vỏng của V. cholerae trờn mụi trường pepton kiềm mặn là mụi trường tăng sinh cú ý nghĩa quan trọng trong cỏc bước của quỏ trỡnh nuụi cấy vỡ nếu trong mẫu bệnh phẩm cú ớt vi khuẩn tả như một số mẫu thực phẩm thỡ việc cấy mụi trường tăng sinh càng đúng vai trũ quyết định nếu khụng sẽ khụng bao giờ phõn lập được vi khuẩn tả trong nước, thực phẩm, là mụi trường cú độ kiềm cao pH = 8,5 và lượng muối mặn đến 30g trờn một lớt mụi trường, nờn khi cấy ở 2-3 giờ đầu cỏc vi khuẩn khỏc bị ức chế chưa mọc được thỡ vi khuẩn tả mọc lấn ỏt, do vậy nuụi cấy trờn mụi trường này cú ý nghĩa làm tăng sinh lượng vi khuẩn lờn nhiều mặt khỏc làm thuần khiết đồng nhất khuẩn lạc. Nếu bị nhiễm khuẩn trong quỏ trỡnh lấy mẫu hoặc nuụi cấy bị nhiễm cũng như bệnh nhõn đó điều trị bằng khỏng sinh phải sau 3 lần cấy chuyển mỗi lần 3 giờ lỳc đú mới cú thể phõn lập được vi khuẩn tả.
Trong nhiều mẫu phõn cú mật độ vi khuẩn cao ( 107
-108/ml phõn ) việc tăng sinh là khụng cần thiết. Canh thang giàu dinh dưỡng thường được sử dụng để phục hồi vi khuẩn, nước pepton kiềm thường được sử dụng nhất, pH của canh thang từ 8,4 - 9,2 thuận lợi cho vi khuẩn phỏt triển. V. cholerae là vi khuẩn hiếu khớ, nhiệt độ thớch hợp là 37oC, phỏt triển tốt trong mụi trường kiềm cú độ pH 8,5 - 9,5 và nồng độ muối đến 15%.
Bảng 3.14. Đặc điểm nuụi cấy trờn mụi trƣờng pepton kiềm Mụi trƣờng tăng sinh Mụi trƣờng thạch kiềm 1 Mụi trƣờng thạch kiềm 2 Mụi trƣờng thạch kiềm 3 Kết luận Pepton 1 8 8 Pepton 2 0 6 6 Pepton 3 0 0 2 2 Tổng cộng 16
Kết quả nghiờn cứu chỳng tụi nhận thấy nếu bệnh nhõn nào mới vào viện chưa điều trị khỏng sinh thỡ việc nuụi cấy phõn lập rất dễ và trả lời kết quả nhanh hơn nhiều so với cỏc bệnh nhõn đó điều trị thuốc khỏng sinh.
Qua theo dừi phiếu điều tra và kết quả phõn lập trờn mụi trường pepton kiềm mặn chỳng tụi cú một số nhận xột ( Bảng 3.14) với 8 bệnh nhõn khi vào viện được lấy bệnh phẩm ngay trước khi điều trị bằng khỏng sinh thỡ nhận thấy trờn mụi trường peptone cấy lần thứ nhất xuất hiện vỏng nghi tả hơi xỏm, mỏng, lắc khú tan, sau 4 giờ xen lẫn với vỏng của tạp khuẩn, sau 8 giờ bằng cỏc phương phỏp khỏc nhau chỳng tụi đó trả lời dương tớnh với V. cholerae. Đồng thời cú 6 bệnh nhõn phõn lập được vi khuẩn tả phải sau 2 lần cấy tăng sinh và 2 bệnh nhõn phải sau 3 lần cấy tăng sinh như vậy mới phõn lập được điều đú hoàn toàn giống cỏc nghiờn cứu khỏc vỡ bệnh nhõn đó điều trị bằng khỏng sinh nờn tỷ lệ vi khuẩn ớt do vậy khú phõn lập hơn. Nếu lấy bệnh phẩm sau 2 ngày sử dụng khỏng sinh thỡ khả năng phỏt hiện mầm bệnh là rất khú.
Một số nhận xột của Thẩm Chớ Mục, Phạm Trọng Năm nhận xột về khuẩn lạc trờn mụi trường đặc và vỏng của V. cholerae mọc trờn mụi trường lỏng sẽ dẫn tới sự nhanh chúng chớnh xỏc trong khõu trả kết quả. Trong đú cú
đưa ra trờn những bệnh nhõn cú bệnh cảnh lõm sàng điển hỡnh khụng phải cấy chuyển giai đoạn 2. Những bệnh nhõn đó dựng khỏng sinh và người lành trong ổ dịch mang vi khuẩn thỡ phải tăng sinh đến giai đoạn 3 hoặc 4 mới phỏt