3.4.1. Tạo plasmid tái tổ hợp INV-pENTR
Để khẳng định chắc chắn rằng đoạn DNA thu đƣợc từ phản ứng RT-PCR chính xác là đoạn gen mã hóa enzyme Invertase, chúng tôi tiến hành việc tiếp theo là tách dòng và xác định trình tự gen. Để việc tách dòng đạt đƣợc hiệu quả nhất chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm RT-PCR theo bộ kit Qiagen của hãng QIAquick Gel Extraction. Quá trình tách dòng đƣợc thực hiện bằng cách gắn sản phẩm RT-PCR vào vector tách dòng pENTR/D của hãng Invitrogen (Mỹ) để tạo “entry clone” INV_pENTR. Vector pENTR/D có kích
thƣớc 2580 bp, trên vector này có hai vị trí gắn attL1 và attL2, đoạn gen cần
chuyển Invertase sẽ đƣợc gắn vào giữa hai vị trí này. Vector này còn có gen kháng kháng sinh kanamycin và có vị trí gắn mồi M13 phục vụ cho việc chọn dòng các khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp INV_pENTR. Ngoài ra, enzyme Topoisomerase sẽ giúp cho việc gắn gen vào vector diễn ra trong một khoảng thời gian rất ngắn (khoảng 5 phút) và có thể đạt hiệu quả cao tới 90%. Thành phần và chu trình của phản ứng đƣợc trình bày ở mục 2.2.4.1. Kết quả của phản ứng sẽ thu đƣợc vector tái tổ hợp INV_pENTR.
3.4.2. Biến nạp plasmid tái tổ hợp INV_pENTR vào tế bào khả biến
E.coli TOP 10
Vector tái tổ hợp INV_pENTR thu đƣợc sau phản ứng lai sẽ đƣợc biến
nạp vào tế bào khả biến E.coli TOP 10 bằng phƣơng pháp sốc nhiệt nhằm
tách dòng và nhân nhanh plasmid tái tổ hợp với số lƣợng lớn. Hiệu quả của phản ứng này phụ thuộc vào chất lƣợng sản phẩm vector tái tổ hợp và tế bào
khả biến. Ở đây, toàn bộ vector tái tổ hợp INV_pENTR sẽ đƣợc biến nạp với tế bào khả biến và đƣợc cấy trải khuẩn trên môi trƣờng có bổ sung kháng sinh
chọn lọc kanamycine 50 mg/l và ủ ở 37oC, qua đêm. Kết quả thu đƣợc các
khuẩn lạc màu trắng trên đĩa môi trƣờng. Song không phải tất cả các khuẩn lạc đều mang plasmid tái tổ hợp INV_pENTR vì bản thân plasmid này có gen
kháng kháng sinh còn tế bào khả biến E.coli lại không kháng bất kỳ kháng
sinh nào. Vì vậy, có thể có một lƣợng nhỏ nào đó các tế bào chứa plasmid pENTR/D nhƣng lại không gắn gen Invertase, do enzyme TOPO ở hai đầu vector bị mất và plasmid tự đóng vòng. Vậy trong số những khuẩn lạc thu đƣợc, khuẩn lạc nào mang vector chứa đoạn gen mã hóa Invertase và khuẩn lạc nào không có? Để xác định rõ các plasmid tái tổ hợp chính là dòng INV_pENTR mong muốn, chúng tôi tiến hành tách chiết plasmid theo Sambrock từ những khuẩn lạc sống sót trên môi trƣờng có bổ sung kháng sinh chọn lọc và thực hiện phản ứng PCR plasmid thu đƣợc với cặp mồi đặc hiệu M13for/rev.
3.4.3. Chọn lọc plasmide tái tổ hợp INV_pENTR bằng PCR với cặp mồi M13 (F/R) M13 (F/R)
Quá trình biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli bằng
sốc nhiệt có hiệu quả có thể tới 95%. Song rất có thể còn có những gen không đƣợc gắn vào và chúng sẽ tồn tại bên trong hoặc xung quanh những khuẩn lạc mọc trên đĩa môi trƣờng chọn lọc. Do đó, PCR plasmid với cặp gen đặc hiệu
3’INV, 5’INV vẫn có thể thu đƣợc những băng có kích thƣớc khoảng 435 bp
nhƣng không có đoạn gen Invertase đƣợc gắn vào vector. Vì vậy, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi M13for/rev đặc hiệu của vector pENTR/D với các plasmid của các dòng khuẩn số 1, 2, 3 để có kiểm tra chính xác xem đoạn gen Invertase đã gắn đƣợc vào vector tách dòng hay chƣa. Theo
lý thuyết thì vị trí gắn mồi M13for/rev trên vector pENTR/D đƣợc thiết kế đặc hiệu và cho phép nhân một đoạn DNA từ nucleotide vị trí 537 tới vị trí 861 trên vector pENTR/D. Nhƣ vậy, PCR với cặp mồi này sẽ thu đƣợc các sản phẩm có chiều dài khoảng 750 bp hoặc 324 bp từ các dòng plasmid INV_pENTR dƣơng hoặc âm tính tƣơng ứng khi kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 0,8%.
Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR plasmid với cặp mồi M13(For/Rev) nhằm kiểm tra sự có mặt của đoạn Invertase
trong vector pENTR/D
(M): Marker 1kb; (1), (2),( 3): sản phẩm PCR từ plasmid INV_ pENTR/D; (-): đối chứng âm
Với kết quả thu đƣợc ở hình 3.3 cho thấy rằng 2 dòng plasmid tái tổ hợp tách từ dòng khuẩn số 1 và 2 cho các băng có kích thƣớc khoảng 750 bp đúng với kích thƣớc của tính toán lý thuyết của các dòng plasmid INV_pENTR dƣơng tính. Nhƣ vậy, có thể kết luận rằng đoạn gen Invertase đã đƣợc gắn và tạo “entry clone” INV_pENTR ở dòng khuẩn số 1 và 2. Dòng plasmid INV_pENTR tái tổ hợp đã đƣợc gửi đi để xác định trình tự đoạn gen Invertase.
750 bp
3.4.4. Kết quả xác định trình tự nucleotit
Đoạn gen mã hóa Invertase đƣợc gửi đi xác định trình tự nuclotide trên máy xác định trình tự tự động ABI PRIMS 3100 Avant Genetic Analyzer. Sau đó, chúng tôi sử dụng phần mềm DNAstar và BioEdit để tiến hành so sánh trình tự nucleotide của đoạn gen mã hóa enzyme Invertase này với trình tự Invertase có mã số AY302083 đã đƣợc sử dụng để thiết kế cặp mồi. Kết quả nhƣ sau:
Hình 3.4. Kết quả so sánh trình tự đoạn gen Invertase phân lập đƣợc với trình tự Invertase trong ngân hàng gen có mã số AY302083
Trên hình 3.4 cho thấy, trình tự gen Invertase phân lập đƣợc ở cây mía
ROC1 in vitro có độ tƣơng đồng khá cao với trình tự gen AY302083 đã đƣợc sử dụng để thiết kế cặp mồi đặc hiệu (90,1%). Điều này chứng tỏ chúng tôi đã
phân lập chính xác đoạn gen mã hóa Invertase mong muốn ở cây mía ROC1
in vitro.
3.5. THIẾT KẾ VECTOR TÁI TỔ HỢP INV-RNAi
3.5.1. Tạo vector tái tổ hợp INV_RNAi bằng kỹ thuật Gateway
Kỹ thuật Gateway Cloning là một kỹ thuật nhân dòng phổ biến và hiệu quả cho việc gắn trình tự DNA vào hệ thống một hoặc nhiều vector. Trong thí 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AY302083 AGGAACTGGATGAACGACCCCAATGGCCCGGTGTACTACAAGGGCTGGTACCACCTGTTCTACCAATACAACCCGGACGGCGCCATCTGGGGCAACAAGA amplified ---CATCTGGGGCAACAAGA 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AY302083 TCGCGTGGGGCCACGCCGTCTCCCGCGACCTCATCCACTGGCGCCACCTCCCGCTGGCCATGCTGCCCGACCAGTGGTACGACACCAACGGCGTCTGGAC amplified TCGCGTGGGGCCACGCCGTCTCCCGCGACCTCATCCACTGGCGCCACCTCCCGCTGGCCATGGTGCCCGACCAGTGGTACGACACCAACGGCGTGTGGAC 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AY302083 GGGCTCCGCCACCACGCTCCCCGACGGCCGCCTCGCCATGCTCTACACCGGCTCCACCAACGCCTCCGTGCAGGTGCAGTGCCTCGCCGTGCCCGCCGAC amplified GGGCTCCGCCACCACGCTCCCCGACGGCCGCCTCGCCATGCTCTACACGGGCTCCACCAACGCCTCCGTGCAGGTGCAGTGCCTCGCCGTGCCCGCCGAC 610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AY302083 GACGCCGACCCGCTGCTCACCAACTGGACCAAGTACGAGGGCAACCCGGTGCTGTACCCGCCGCCGGGCATCGGGCCCAAGGACTTCCGCGACCCCACCA amplified GACGCCGACCCGCTGCTCACCAACTGGACCAAGTACGAGGGCAACCCGGTGCTGTACCCGCCGCCGGGGATCGGGCCCAAGGACTTCCGCGACCCCACCA 710 720 730 740 750 760 770 780 790 800 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AY302083 CGGCGTGGTTCGACCCGTCGGACAACACCTGGCGCATCGTCATCGGCTCCAAGGACGACGCCGAGGGCGACCACGCCGGCATCGCCGTGGTGTACCGCAC amplified CGGCGTGGTTCGACCA---
nghiệm này chúng tôi thực hiện phản ứng LR với các thành phần đã trình bày ở mục 2.2.2.1. để gắn vector INV_pENTR với vector pK7GWIWG2(II) nhằm
thu đƣợc vector chuyển gen INV_RNAi của gen mã hóa Invertase. Phản ứng
này đƣợc tiến hành với sự xúc tác của enzyme LR-clonase và Proteinase K ở nhiệt độ phòng.
pK7GWIWG2(II) là một vector chuyển gen đƣợc cấu trúc bởi hai vùng
gắn đặc biệt là: attR1-ccdB-attR2 có chiều ngƣợc nhau và đƣợc nối với nhau
nhờ một đoạn intron. Do đó, khi thực hiện phản ứng lai LR thì sẽ tạo ra sản phẩm là một plasmid INV_RNAi có hai vị trí gắn mang đoạn gen Invertase có chiều ngƣợc nhau: sense-intron-antisense (Invertase-intron-antiInvertase). Đoạn intron của vector pK7 có vai trò rất quan trọng trong việc tạo đoạn thắt nút (vòng) để RNA sợi đôi dễ đƣợc hình thành (Invertase-intron- antiInvertase) và hoạt động một cách ổn định trong genome của vật chủ khi nó đƣợc chuyển vào. Đây chính là cấu trúc RNAi cần thiết kế để chuyển gen vào cây mía nhằm tăng trữ lƣợng đƣờng của mía cao hơn một cách ổn định.
Hình 3.5. Mô hình cấu trúc chuyển gen INV_RNAi 3.5.2. Biến nạp vector INV_RNAi vào tế bào khả biến E.coli
Vector tái tổ hợp INV_RNAi đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli
TOP 10 bằng phƣơng pháp sốc nhiệt ở 42oC với khoảng thời gian là 1 phút 30
giây. Sau đó, khuẩn sẽ đƣợc nuôi phục hồi với 250 μl LB lỏng ở 37oC ở tủ lắc
có kháng sinh 100 mg/l spectinomycin, 40 mg/l streptomycin và 50 mg/l chloramphenicol. Kết quả thu đƣợc một lƣợng lớn các khuẩn lạc màu trắng mọc trên môi trƣờng chọn lọc.
Vector pK7GWIWG2(II) là vector có cấu trúc mang gen kháng các
kháng sinh spectinomycin, streptomycin, chloramphenicol và gen ccdB mã
hóa cho plasmid F gây ức chế sinh trƣởng của tế bào E.coli, còn vector
INV_RNAi không có gen ccdB do gen Invertase chèn vào thay thế. Vì vậy,
các khuẩn lạc mọc trên đĩa môi trƣờng chọn lọc chỉ có thể là những khuẩn lạc
có mang plasmid pK7GWIWG2(II) nhƣng vị trí chứa đoạn gen ccdB đã bị đột
biến và các khuẩn lạc có mang plasmid INV_RNAi. Chọn ngẫu nhiên 3 khuẩn lạc đƣợc đánh số từ 1 đến 3 nuôi trong môi trƣờng lỏng có các kháng sinh chọn lọc tƣơng tự và tiến hành tách plasmid từ các dòng khuẩn đó. Để kiểm tra các plasmid thu đƣợc có chính xác là INV_RNAi hay là pK7GWIWG2(II)
nhƣng vị trí chứa đoạn gen ccdB đã bị đột biến. Chúng tôi thực hiện phản ứng
cắt enzyme giới hạn đặc hiệu XbaI và HindIII đối với 3 plasmid từ khuẩn lạc
số 1, 2 và 3. Theo tính toán trên lý thuyết thì sản phẩm của phản ứng cắt enzyme sẽ cho 3 đoạn có kích thƣớc là: Đoạn 1 dài 978 bp mang đoạn
Invertasechiều xuôi, đoạn 2 dài 2825 bp mang đoạn Invertase chiều ngƣợc và
cuối cùng là phần còn lại của vector nhận pK7GWIWG(II) dài 8114 bp. Hình 3.6 cho thấy sản phẩm của phản ứng cắt enzyme thu đƣợc các phân đoạn có các kích thƣớc tƣơng ứng với dự tính ở cả 3 plasmid 1, 2 và 3 và có sự khác biệt rõ rệt so với đối chứng là vector không biến nạp pK7GWIWG(II), chứng tỏ cấu trúc INV_RNAi đã đƣợc thiết kế.
Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid INV_RNAi tổ hợp với
HindIII và XbaI
(M): Marker 1kb; (1), (2), (3): các dòng plasmid tái tổ hợp; (-): đối chứng vector pK7GWIWG(II)
3.6. BIẾN NẠP VECTOR CHUYỂN GEN INV_RNAi VÀO CHỦNG VI
KHUẨN A.TUMEFACIENS CV58C1.
Để kiểm tra hoạt động của cấu trúc INV_RNAi trên vector tái tổ hợp trong cây trồng cũng nhƣ tạo nguyên liệu cho quá trình chuyển gen ức chế biểu hiện gen mã hóa Invertase ở cây mía, thì cấu trúc INV_RNAi phải đƣợc
biến nạp vào vi khuẩn A.tumefaciens CV58C1 bằng phƣơng pháp xung điện.
Đây là một phƣơng pháp biến nạp có hiệu quả cao trong thời gian ngắn.
Plasmid tái tổ hợp INV_RNAi số 2 đƣợc biến nạp vào A.tumefaciens bằng
xung điện với thành phần và các bƣớc tiến hành biến nạp đƣợc trình bày ở mục 2.2.2.3. Kết quả cho thấy trên đĩa môi trƣờng có bổ sung kháng sinh chọn lọc 100 mg/l streptomycin, 100 mg/l spectinomycin và 50 mg/l rifamycin thu đƣợc những khuẩn lạc màu trắng. Sau đó chọn ngẫu nhiên 2 dòng khuẩn lạc nhân nuôi trong môi trƣờng lỏng có bổ sung các kháng sinh
chọn lọc 100 mg/l streptomycin, 100 mg/l spectinomycin và 50 mg/l
Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR plasmid INV-RNAi trong
A.tumefaciens với cặp mồi đặc hiệu 5’INV và 3’INV
(M):Marker 1kb; (1), (2): các dòng plasmid tái tổ hợp; (-): đối chứng âm
Tách plasmid theo Sambroock và kiểm tra sự có mặt của INV_RNAi
trong A.tumefaciens CV58C1 bằng phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu
5’INV và 3’INV. Kết quả kiểm tra hình 3.7 cho thấy các dòng khuẩn lạc đều cho kết quả dƣơng tính kích thƣớc khoảng 450 bp mong muốn. Nhƣ vậy, chứng tỏ chúng tôi đã tạo đƣợc vector chuyển gen INV_RNAi trong chủng vi
khuẩn A.tumefaciens CV58C1. Đây là nguồn nguyên liệu phục vụ cho thí
nghiệm chuyển gen tiếp theo nhằm tạo dòng mía bất hoạt gen mã hoá Invertase, tăng lƣợng sucrose tích trữ.
3.7. TÁI SINH VÀ BƢỚC ĐẦU BIỂU HIỆN GEN GUS Ở MÍA 3.7.1. Quy trình tái sinh mía thông qua mô sẹo 3.7.1. Quy trình tái sinh mía thông qua mô sẹo
Từ các nghiên cứu tái sinh và chuyển gen thành công ở cây mía cho thấy rằng tỉ lệ tái sinh thu đƣợc cao và hiệu quả thông qua nguyên liệu ban đầu là mô sẹo. Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành thử nghiệm tạo mô
sẹo với giống mía ROC10 in vitro trên môi trƣờng MS đối chứng không có
2,4D và các môi trƣờng cảm ứng tạo mô sẹo M1-M4 (Bảng 2.4). Kết quả thu đƣợc cho thấy ở môi trƣờng đối chứng MS (không có 2,4D) hoàn toàn không
tạo đƣợc mô sẹo. Còn các mẫu trên môi trƣờng cảm ứng có bổ sung hàm lƣợng chất kích thích sinh trƣởng 2,4D đều tạo đƣợc mô sẹo và cho hiệu quả tái sinh mía đƣợc thể hiện thông qua bảng sau:
Bảng 3.3. Khả năng tạo mô sẹo và tái sinh ở giống mía ROC10 in vitro
trên các môi trƣờng thử nghiệm M1 - M4.
Môi trƣờng 2,4-D (mg/l) Tổng mẫu cấy Tỉ lệ tạo mô sẹo (%) Tỉ lệ mẫu tạo chồi (%) Số chồi / 1 khối mô sẹo
M1 3 3x130 83,07 ± 0,44 67,95 ± 1,36 42,66 ± 1,45
M2 4 3x130 86,15 ± 3,11 46,41 ± 3,33 20,66 ± 2,96
M3 5 3x130 71,79 ± 0,68 63,08 ± 1,33 32,33 ± 1,45
M4 6 3x130 83,33 ± 2,89 37,95 ± 1,12 17,66 ± 4,33
Bảng 3.3 cho thấy, các mẫu ở môi trƣờng M1 có bổ sung 3 mg/l 2,4D cho tỉ lệ tạo mô sẹo và hiệu suất tái sinh cao hơn hẳn so với các môi trƣờng M2 - M4 có bổ sung 4, 5, 6 mg/l 2,4D; trong đó tỉ lệ tạo chồi đạt 67,95% và số chồi trên một khối mô sẹo đạt khoảng 42,66. Nhƣ vậy, môi trƣờng M1 có
bổ sung 3 mg/l 2,4D cho kết quả tạo mô sẹo và tái sinh cây ở mía ROC10 in
vitro tốt nhất trong thí nghiệm này. Do đó, chúng tôi chọn môi trƣờng M1 có bổ sung 3 mg/l 2,4D làm môi trƣờng cảm ứng tạo mô sẹo cho việc tái sinh và chuyển gen ở mía trong các thí nghiệm tiếp theo. Quá trình tái sinh cây từ mô sẹo đến cây hoàn chỉnh đƣợc minh họa trong hình 3.8.
Mặt khác, chúng tôi tiếp tục nhân nuôi mô sẹo trong môi trƣờng lỏng
lắc M1 có bổ sung 3 mg/l 2,4D trong vòng 1 tuần, ở 27oC, lắc 90 vòng/phút,
Cây mía ROC10 in vitro Đoạn thân sát gốc dài 0,5 cm trên môi trƣờng cảm
ứng tạo mô sẹo
Mô sẹo
Tạo cây hoàn chỉnh Mô sẹo lên mầm xanh Mô sẹo đang nhú mầm
Hình 3.8. Quy trình tái sinh mía ROC10in vitro từ mô sẹo 3.7.3. Chọn lọc mô sẹo và tái sinh cây chuyển gen
Quy trình chuyển gen có hiệu quả là yếu tố rất quan trọng trong việc chuyển gen vào thực vật. Sau khi thử nghiệm đƣợc môi trƣờng tái sinh cây mía thông qua mô sẹo, chúng tôi tiến hành thử nghiệm việc chuyển gen vào
cây mía thông qua việc sử dụng gen chỉ thị gus-intron. Trong nghiên cứu này,
chúng tôi thử nghiệm hai chủng vi khuẩn A.tumefaciens khác nhau là
EHA1300 và CV58C1 cùng mang vector chuyển gen pPTN289, ngƣỡng thời gian nhiễm khuẩn là 10 và 30 phút.