CL – 4B dextran sulfate
Cột Sepharose CL – 4B dextran sulfate là cột sắc ký ái lực, do đĩ khi cho dung dịch protein cĩ chứa HBsAg đi qua, cột sẽ giữ lại HBsAg trên cột nhờ cĩ ái lực với dextran sulfate gắn trên gel. Sau khi đẩy bằng dung dịch đẩy ta sẽ thu đƣợc HBsAg (peak thứ 2 phần bám trên cột).
Dung dịch thu đƣợc (phần bám trên cột) sau khi qua cột Sepharose CL – 4B dextran sulfate sau khi định lƣợng miễn dịch xác định hàm lƣợng kháng nguyên HBsAg bằng kit Architect®HBsAg (Abbott) chúng tơi thu đƣợc kết quả:
Hàm lƣợng kháng nguyên HBsAg trong 1ml đã pha lỗng 105 lần là:
0,39 mUI.
Hình 4.4. Đồ thị sắc ký ái lực thực hiện trên máy Explorer với cột Sepharose CL - 4B dextran sulfate.
Do HBsAg cĩ trọng lƣợng phân tử lớn 3.106 Da nên chúng tơi đã sử dụng
phƣơng pháp điện di trên 15% SDS – PAGE – DTT, với mục đích sử dụng DTT để cắt phân tử protein cĩ cấu trúc phức tạp trong dung dịch thu đƣợc sau khi qua cột (phần bám trên cột) thành những đoạn cĩ cấu trúc đơn giản cĩ thể phân tách đƣợc trên gel.
Hình 4.5. Kết quả điện di 15% SDS - PAGE – DTT sau khi qua cột Sepharose CL – 4B dextran sulfate
Giếng Mẫu Lƣợng mẫu(µg) 1 Đoạn bám trên Sepharose dextran sulfate (E14) 21,37 2 Đoạn bám trên Sepharose dextran sulfate (E14) 21,37 3 Đoạn bám trên Sepharose dextran sulfate (E14) 21,37 4 Đoạn bám trên Sepharose dextran sulfate (E14) 21,37 5 Marker 6 Lysozyme 4 Albumin 5,3 Marker: hãng Invitrogen Vị trí Trọng lƣợng phân tử (kDa) 1. Myosin 250 2. Phosphorylase 148 3. Glutamin dehydrogenase 60 4. Carbonic anhydrase 42 5. Myoglobin – blue 30 6. Myoglobin – red 22 7. Lysozyme 17 8. Aprotinin 6 9. Insulin – B chain 4
Bảng 4.3. Kết quả thu đƣợc sau tồn bộ quá trình tinh chế HBsAg Giai đoạn V (ml) Hoạt tính KN (mUI) Hoạt tính ( %) OD OD (%) Hoạt tính/ OD (mUI/OD) Độ tinh khiết (lần) Huyết thanh 113,5 6505.10 3 100 8830,3 100 0,736.103 (NH4)2SO4 15 2830.103 43,5 2058 23 1,37.103 1,86 Sephacryl 20 3000.103 46 118,26 1,3 25,36.103 34,4 Sepharose CL 4B – dextran sulfate 36 1406.103 21,6 43,4 0,49 32,35.103 44 Nhận xét
Dựa vào kết quả điện di hình 4.5 cùng với thang chuẩn (marker), chúng tơi rút ra kết luận:
Dung dịch sau khi qua cột Sepharose CL – 4B dextran sulfate:
Chứa các phân tử protein cĩ trọng lƣợng phân tử từ 25 – 28 kDa, trùng với các kết quả của các tác giả khác khi nghiên cứu và chạy điện di với HBsAg đã đƣợc tinh chế.
Hàm lƣợng kháng nguyên HBsAg so với hàm lƣợng protein tổng số tăng lên đáng kể 32,35.103
mUI/ OD
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận
Qua thời gian tƣơng đối ngắn thực hiện đề tài tại Phịng Miễn Dịch, Viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh, với mục tiêu của khố luận là “tinh chế kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HBsAg)”. Với các kết quả thực nghiệm đạt đƣợc trên, chúng tơi đạt một số kết quả sau:
HBsAg đã đƣợc tinh chế với hoạt tính kháng nguyên HBsAg so với hàm lƣợng protein tổng số là 32,35.103
mUI/ OD.
HBsAg đƣợc tinh chế với độ tinh chế 44 lần. Kết quả này tƣơng đƣơng với
kết quả tinh chế của các tác giả khác trên thế giới.
HBsAg đƣợc tinh chế khá tốt, kết quả đƣợc thể hiện trên gel điện di: dung dịch HBsAg thu đƣợc chứa các băng cĩ trọng lƣợng phân tử từ 25 – 28 kDa tƣơng ứng với các quyết định kháng nguyên của HBsAg.
5.2. Đề nghị
Vì thời gian thực hiện đề tài cĩ hạn, nên chúng tơi chỉ cĩ thể tinh chế HBsAg. Do đĩ, chúng tơi cĩ đề nghị sau:
Kiểm tra độ đặc hiệu của dịch thu đƣợc bằng phƣơng pháp Western Blot để đánh giá chính xác kháng nguyên HBsAg .
Tiếp tục tinh chế HBsAg với độ tinh chế cao hơn để cĩ thể sử dụng làm kháng nguyên gây miễn dịch trên súc vật thí nghiệm để thu kháng thể tƣơng ứng.
Và trong tƣơng lai tạo bộ sinh phẩm dùng chẩn đốn phát hiện virus viêm gan B trong máu.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT .
1. TS.BS Trần Hữu Hầu, 2001. Tìm hiểu viêm gan virus B. NXB Y học, TpHCM.
2. PGS.TS Nguyễn Thanh Bảo, 2004. Virut học. ĐH Y Dƣợc TpHCM – Khoa Y - Bộ mơn Vi Sinh, NXB Y học TpHCM
3. PGS.TSKH Nguyễn Thu Vân, 2002. Viêm gan virut B và văcxin dự phịng. NXB Y học, Hà Nội.
4. Nguyễn Thu Vân, Hồng Thuỷ Nguyên và Howard A.Fields,1992. Tình trạng nhiễm các loại virus viêm gan A, B, C, D trong những nhĩm người khác nhau và việc nghiên cứu ứng dụng sản xuất vaccine viêm gan B ở Việt Nam.Tạp chí vệ sinh phịng dịch, tập II, số 1.
TIẾNG NƢỚC NGỒI
5. Terrance G. Cooper, 1977. The tools of biochemistry. 6. David Freifelder, 1976. Physical biochemistry.
7. Pharmacia Fine Chemicals. Ion exchance chromatography: Principle and methods.
8. Amersham Pharmacia Biotech. Affinity chromatography: Principle and methods.
9. Melnick J. W., 1981. Historical aspects of hepatitis B vaccine. (P. Maupas and P. Guesry, eds). INSERM Symposium No 18, Elsevier/ North – Holland Biomedical Press, Amsterdam.
10.Darrel L. Peterson, 1981. Isolation and characterization of major protein and glycoprotein of hepatitis B surface antigen. Journal of biological chemistry. 11.Monica Einarsson, Lennar Kaplan and Govan Utle, 1978. Purification of
12.Lin JY, Hsieh YS, Chu SC. The isolation and purification of pre – S2 containing Hepatitis B virus surface Antigen by Chemical Affinity Chromatography. Insitute of Biochemistry.
13.Amersham Pharmacia Biotech. Gel Permeation Chromatography: Principle and Methods. INTERNET 14. http://www.infekt.ch 15. http://www.dgk.de/web/dgk_content/de/bildarchiv_erreger.htm 16. http://www.socgenmicrobiol.org.uk/JGVDirect/18197/18197ft.htm 17. http://courses.cm.utexas.edu/jrobertus/ch339k/overheads-1.htm 18. http://www. virolory-online.com 19. http://www. tamm.ebc.ee/~iilves/ hepatiit/hepatiit.html 20. www-micro.msb.le.ac.uk/ 3035/HBV.html 21. http://www.dgk.de/web/dgk_content/de/bildarchiv_erreger.htm