Thực hiện phản ứng theo mục 3.4.5.2 nhƣng kết quả không thành công. Tiếp tục thực hiện phản ứng đồng thời thay đổi nồng độ thành phần nhƣng kết quả vẫn không ra. Do đó, chƣa thể khẳng định 4 dòng phân lập đƣợc từ bƣởi Da Láng và bƣởi Đƣờng Cam tại Đồng Nai là Xanthomonas. axonopodis pv. citri.
Nhận xét lý do kết quả không thực hiện đƣợc: -Chất lƣợng DNA mẫu chƣa tốt, còn tạp nhiều. -Nguồn vi khuẩn phân lập còn ít.
Dựa vào kết quả đạt đƣợc có thể rút ra thảo luận: phƣơng pháp sinh học phân tử có thể hổ trợ cho phƣơng pháp định danh bằng nuôi cấy, thử nghiệm sinh hóa. Phƣơng pháp sinh học phân tử cụ thể là phƣơng pháp PCR, giải trình tự có thể định danh ở mức loài, tìm ra loài mới, nghiên cứu đƣợc sự đa dạng di truyền: năm 2002, Edmilson R.Goncalves và ctv đã tiến hành phân tích mối quan hệ di truyền giữa 17 loài Xanthomonas.sp bằng thực hiên phản ứng PCR và đọc trình tự sản phẩm PCR.Phản ứng đƣợc thực hiện với cặp mồi Xan1330 và Xan332 đƣợc thiết kế trên đoạn 16s-23s rDNA ITS.
Dựa trên kết quả phân tích và thực hiện các thí nghiệm có thể đƣa ra những bƣớc cơ bản để định danh dòng vi khuẩn gây bệnh loét trên cây có múi dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử. Các bƣớc cơ bản đó là :(Hình 4.7)
xii (5b) (5a) (4) (3b)
Phân lập, nuôi cấy, quan sát hình thái đặc trƣng trên các môi trƣờng khác nhau, xác định gram (N.W. Schaad và ctv, không rõ năm )
Chủng bệnh nhân tạo để kiểm tra lại triệu chứng gây bệnh của dòng vi khuẩn phân lập đƣợc ( N.W. Schaad và ctv, không rõnăm )
Kiểm tra sinh hóa (N.W. Schaad và R. E.
Stall, không rõ năm )
Thực hiện sắc ký bản mỏng dựa vào sắc tố đặc trƣng để nhận biết dòng
Xanthomonas.sp (N.W. Schaad và R. E. Stall, không rõ năm )
Thực hiện phản ứng PCR trên 16s-23s r DNA ITS với cặp primer Xan1330, Xan332 (M. H. R.
Khoodoo và ctv, 2005)
Giải trình tự sản phẩm PCR, đối chiếu kết quả trên http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST
Tiến hành PCR trên vùng hrpW gen với cặp mồi chuyên biệt XACR và XACF cho phép xác định nhanh Xanthomonas
axonopodis pv. citri
( Dong Suk Park và ctv, 2006)
Hình 4.7. Các bƣớc cơ bản để định danh dòng vi khuẩn gây bệnh loét trên cây có múi dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử.
(1)
(2)
Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ