Ba dòng vi khuẩn đƣợc trộn vào hỗn hợp tiếp hợp theo tỉ lệ thích hợp. E.coli
DH5α (λ-pir) chứa plasmid hỗ trợ pRK600 không thể tiếp hợp thành công với
Pseudomonas fluorescens vì không có vùng tƣơng đồng, và không thể duy trì trong
Pseudomonas fluorescens vì có điểm khởi đầu sao chép colE1.
Theo Cameron (2007) gene tra+ trên pRK600 gây nên sự hình thành pili, kéo vi khuẩn cho E.coli DH5α (λ-pir) có chứa plasmid pUT-gfp lại gần, làm tan vách tế bào của vi khuẩn, hình thành cầu nguyên sinh chất. Tra+ cũng gây đứt gãy DNA tại
Hình 4.5: Đối chứng trên môi trƣờng M9.
(A) E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pUT-gfp, (B) E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pRK600, (C) Pseudomonas fluorescens 1.8
B C
42
oriT (mob) và làm pRK600 duỗi ra. Một mạch đơn của pRK600 đƣợc chuyển vào thể cho E.coli DH5α. Lúc này có 2 plasmid trong thể cho. Gene tra+ trên pRK600 lại gây nên sự hình thành pili, kéo thể nhận Pseudomonas fluorescens lại gần, hình thành cầu nối nguyên sinh chất. Đồng thời tra+ cũng gây đứt gãy DNA tại oriT RP4, khởi đầu sự chuyển pUT-gfp vào thể nhận. Trong thể nhận, sự tái tổ hợp xảy ra giữa pUT-gfp và DNA bộ gene của thể nhận nhờ hệ thống transposon mini-Tn5. Các thể tái tổ hợp sau đó sẽ đƣợc chọn lọc trên môi trƣờng có chứa kháng sinh kanamycin 50µg/ml, ampicillin 50µg/ml và chloramphenicol 20µg/ml.
4.2.3 Kết quả đối chứng
Dòng vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) có chứa plasmid pUT-gfp không mọc đƣợc trên môi trƣờng M9 vì chúng không kháng đƣợc với chloramphenicol (20µg/ml) có trong môi trƣờng.
Dòng vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) có chứa plasmid pRK600 kháng đƣợc với kanamycin (50µg/ml), ampicillin (50µg/ml) và cả chloramphenicol (20µg/ml) nên môi trƣờng M9 chúng tôi sử dụng không loại bỏ đƣợc dòng này.
Dòng vi khuẩn nhận Pseudomonas fluorescens 1.8 không kháng đƣợc với kanamycin (50µg/ml) nhƣng khi nuôi riêng dòng vi khuẩn này qua các bƣớc nhƣ quy trình tiếp hợp nêu trên chúng vẫn có thể hình thành khuẩn lạc trên môi trƣờng M9 (có chứa kanamycin 50µg/ml, ampicillin 50µg/ml và chloramphenicol 20µg/ml). Để loại trừ trƣờng hợp kháng sinh kanamycin bị mất hoạt tính khi bổ sung vào môi trƣờng, chúng tôi cấy trực tiếp dòng Pseudomonas fluorescens 1.8 lên môi trƣờng M9 bằng phƣơng pháp cấy điểm mà không nuôi qua các bƣớc nhƣ quy trình tiếp hợp. Kết quả vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 1.8 không mọc đƣợc trên môi trƣờng M9. Nhƣ vậy, chúng tôi cho rằng trong quy trình tiếp hợp, khi nuôi chung trên môi trƣờng KB có một cơ chế nào đó đã xảy ra làm cho dòng vi khuẩn nhận dù không nhận đƣợc plasmid vẫn có thể mọc đƣợc trên môi trƣờng chọn lọc có kháng sinh.
43
4.2.4 Môi trƣờng thích hợp cho chọn lọc
Môi trƣờng M9 có chứa các loại kháng sinh kanamycin, ampicillin, và chloramphenicol không phải là môi trƣờng chọn lọc thích hợp trong nghiên cứu này. Vì M9 là 1 loại môi trƣờng thích hợp cho cả Pseudomonas và E.coli nên khi chọn lọc phải dựa vào tính kháng kháng sinh của các dòng vi khuẩn. Điều này gây ra nhiều bất lợi
Thứ nhất là phải kiểm tra chặt chẽ tính kháng kháng sinh của dòng vi khuẩn nhận. Dòng này phải kháng đƣợc với ít nhất một loại kháng sinh mà dòng vi khuẩn cho và vi khuẩn hỗ trợ không kháng đƣợc. Dòng này lại phải là dòng nhạy với kanamycin hoặc ampicillin để nếu chúng không nhận đƣợc plasmid thì sẽ không mọc đƣợc trên môi trƣờng chọn lọc. Vì phải đáp ứng khắt khe về khả năng kháng kháng sinh nên những dòng Pseudomonas có khả năng kháng kháng sinh phù hợp để chọn lọc thƣờng không phải là dòng đối kháng mạnh với nấm gây bệnh hoặc không phát sáng mạnh trên môi trƣờng KB.
Thứ hai là kháng sinh sau khi đƣợc bổ sung vào môi trƣờng bị phân hủy rất nhanh chóng bởi nhiệt độ và ánh sáng. Do đó khi chọn lọc cần sử dụng nồng độ kháng sinh cao nên rất tốn kém, ngoài ra chúng ta cũng không biết đƣợc chính xác nồng độ kháng sinh còn trong môi trƣờng.
Để khắc phục những vấn đề trên, chúng tôi đề nghị 2 giải pháp:
(i) Chúng ta có thể sử dụng loại môi trƣờng chọn lọc riêng cho
Pseudomonas. Có nhiều loại môi trƣờng chọn lọc cho Pseudomonas dựa trên các loại sắc tố chúng tiết ra môi trƣờng. Ví dụ nhƣ môi trƣờng có potassium sulphate và magnesium chloride. Hai chất này giúp tăng cƣờng khả năng tạo pyocyanin. Đây là loại sắc tố xanh lục hơi ngả sang xanh lá cây do Pseudomonas tiết ra môi trƣờng xung quanh khuẩn lạc. Dựa vào sắc tố chúng ta có thể chọn lọc Pseudomonas, loại bỏ các dòng E.coli.
(ii) Bổ sung vào quy trình tiếp hợp nêu trên một bƣớc cấy điểm sang môi trƣờng KB. Khi khuẩn lạc hình thành, đem chiếu dƣới tia UV để xác định và loại bỏ các dòng E.coli.
44
Nhƣ vậy, dòng Pseudomonas fluorescens đƣợc chọn làm vi khuẩn nhận chỉ cần đáp ứng điều kiện không kháng với kanamycin, môi trƣờng chọn lọc cũng chỉ cần bổ sung loại kháng sinh này để chọn lọc dòng Pseudomonas fluorescens đã nhận đƣợc plasmid.
4.2.5 Quy trình tiếp hợp tối ƣu cho dòng vi khuẩn nhận Pseudomonas
fluorescens 1.8
Để chứng tỏ những nhận định trên chúng tôi thực hiện lại thí nghiệm chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần với quy trình đƣợc sửa đổi nhƣ sau:
1. Nuôi riêng 3 dòng vi khuẩn trong tủ lắc định ôn ở 28oC, tốc độ lắc 150 vòng/phút, trong 20 giờ.
o Vi khuẩn cho: Vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pUT-gfp trong 5ml môi trƣờng LB chứa ampicillin (50 µg/ml) và kanamycin (50 µg/ml).
o Vi khuẩn hỗ trợ: Vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pRK600
trong 5 ml môi trƣờng LB chứa chloramphenicol (20 µg/ml).
o Vi khuẩn nhận: Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 1.8 trong 5ml LB chứa chloramphenicol (20 µg/ml).
2. Hút lần lƣợt 3 dòng với tỉ lệ vi khuẩn cho: vi khuẩn hỗ trợ: vi khuẩn nhận = 1:1:3 = 300µl: 300 µl: 900 µl cho vào ependorf 1.5 ml, vortex kỹ, ly tâm 12.000 vòng/phút ở 200C trong 1 phút. Thu sinh khối, rửa lại với 1 ml nƣớc cất vô trùng. Cho thêm vào ependorf 100 - 200 µl nƣớc cất vô trùng hòa tan sinh khối, đem vortex kỹ.
3. Cấy dịch vi khuẩn lên đĩa môi trƣờng LB agar, bằng cách sử dụng micropipet nhỏ từng giọt (khoảng 10µl ) lên môi trƣờng, ủ 24 giờ ở 28oC.
4. Sau khi khuẩn lạc hình thành, cho tiếp 1ml nƣớc cất vô trùng vào đĩa petri hòa tan các khuẩn lạc. Pha loãng dịch khuẩn. Tiếp tục hút khoảng 30 µl dịch vi
khuẩn sang đĩa môi trƣờng M9 (chứa kanamycin 50µg/ml) trang đều trên mặt đĩa, ủ 48 giờ ở 280
45
Chọn những khuẩn lạc riêng biệt, sử dụng que tăm đã hấp, sấy cấy điểm sang đĩa môi trƣờng M9 (chứa kanamycin 50µg/ml), ủ 24 giờ ở 280C. Từ đĩa M9 này tiếp tục cấy điểm các khuẩn lạc sang đĩa môi trƣờng KB, giữ đúng vị trí các khuẩn lạc nhƣ trên môi trƣờng M9. Ủ 24 giờ ở 280
C.
Đối chứng cũng đƣợc thực hiện bằng cách nuôi riêng 3 dòng vi khuẩn cho, nhận và hỗ trợ theo quy trình đƣợc trình bày trong mục 4.2.5.
Kết quả đối chứng đƣợc trình bày trong hình 4.6.
Kết quả đối chứng cho thấy dòng Pseudomonas fluorescens 1.8 chƣa tiếp hợp không mọc đƣợc trên môi trƣờng M9 (chứa kanamycin 50µg/ml). Nhƣ vậy, các dòng vi khuẩn hình thành khuẩn lạc là vi khuẩn cho, vi khuẩn nhận đã tiếp hợp và vi khuẩn hỗ trợ.
Các dòng vi khuẩn sau khi hình thành khuẩn lạc trên môi trƣờng KB đƣợc đem chiếu dƣới tia UV. Những dòng phát sáng là các dòng Pseudomonas fluorescens đã tiếp hợp, còn những dòng không phát sáng là các dòng vi khuẩn
E.coli cho và hỗ trợ. Chỉ chọn những dòng phát sáng, loại bỏ những dòng không phát sáng.
Nhƣ vậy, qua hai bƣớc chọn lọc: chọn lọc bằng kháng sinh và chọn lọc dựa vào khả năng phát sáng trên môi trƣờng KB, chúng ta có thể thu đƣợc những dòng
Pseudomonas fluorescens đã tiếp hợp. Do đó, chúng tôi kết luận quy trình đƣợc
A B C
Hình 4.6: Kết quả đối chứng.
(A) dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens chưa tiếp hợp, (B) dòng vi khuẩn E.coli có chứa plasmid hỗ trợ pRK600, (C) dòng vi khuẩn E.coli có chứa plasmid pUT-gfp
46
trình bày trong mục 4.2.5 là quy trình tối ƣu cho việc chuyển gene gfp vào vi khuẩn
Pseudomonas fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần.
So với nghiên cứu của Đỗ Thị Ngọc Hân (2006), chúng tôi đã tìm ra phƣơng pháp chọn lọc thích hợp hơn để thu nhận đƣợc các dòng Pseudomonas fluorescens
đã tiếp hợp. Với quy trình tiếp hợp mà chúng tôi đã phát triển việc chọn lọc dòng vi khuẩn nhận thích hợp để làm đối tƣợng nghiên cứu cũng dễ dàng hơn rất nhiều vì không phải phụ thuộc quá chặt chẽ vào tính kháng kháng sinh của các dòng vi khuẩn nhận. Tuy nhiên, hạn chế của đề tài này là chúng tôi không thực hiện PCR để kiểm tra sự hiện diện của gene gfp trong vi khuẩn Pseudomonas fluorescens sau khi tiếp hợp. Và do hạn chế về máy móc chúng tôi cũng không thực hiện đƣợc việc quan sát các tế bào vi khuẩn dƣới kính hiển vi phát huỳnh quang để chọn ra dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens tiếp hợp có biểu hiện phát sáng mạnh.
Chúng tôi đã đƣa ra quy trình tối ƣu để chuyển DNA plasmid vào vi khuẩn bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần, tạo tiền đề để so sánh hiệu quả chuyển gene bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần với phƣơng pháp biến nạp bằng cách xử lý với calcium chloride mà Phạm Duy và Huỳnh Văn Thái (2005) đã trình bày trong nghiên cứu “Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn
E.coli DH5α”, góp phần chọn ra phƣơng pháp thích hợp để thực hiện mục đích chuyển các gene mong muốn vào tế bào vi khuẩn để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
47
Chƣơng 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 Kết luận
Chúng tôi đã khảo sát và tìm ra quy trình thích hợp để chuyển gene gfp vào
vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần. Quy
trình này không đòi hỏi phải sử dụng nhiều loại kháng sinh để chọn lọc, dòng vi
khuẩn nhận không cần đáp ứng điều kiện phải kháng với ít nhất một loại kháng sinh
mà vi khuẩn cho và vi khuẩn hỗ trợ không kháng đƣợc. Do đó có thể dễ dàng chọn
đƣợc dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens thích hợp làm đối tƣợng nghiên cứu.
Thay vì sử dụng nhiều loại kháng sinh chúng ta có thể dựa vào đặc điểm của
Pseudomonas fluorescens là phát sáng trên môi trƣờng KB để phân biệt giữa
Pseudomonas fluorescens và các dòng vi khuẩn E.coli cho và hỗ trợ.
Trong quá trình tiếp hợp, nuôi chung 3 dòng vi khuẩn trên môi trƣờng LB agar sẽ cho kết quả chọn lọc tốt hơn là nuôi chung trên môi trƣờng KB. Cơ chế của hiện tƣợng này chúng tôi chƣa giải thích đƣợc.
Hạn chế của đề tài này là chúng tôi không thực hiện đƣợc giai đoạn chạy PCR để kiểm tra sự hiện diện của gene gfp trong vi khuẩn Pseudomonas fluorescens
sau khi tiếp hợp.
5.2 Đề nghị
Một số hƣớng phát triển của đề tài:
Chuyển gene bằng phƣơng pháp điện biến nạp và so sánh hiệu quả giữa hai phƣơng pháp.
Thực hiện PCR để kiểm tra sự hiện diện của gene gfp trong vi khuẩn
Pseudomonas fluorescens sau khi tiếp hợp.
Quan sát dƣới kính hiển vi phát huỳnh quang các dòng Pseudomonas fluorescens đã chuyển gene gfp để chọn ra dòng có biểu hiện phát sáng mạnh.
48
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Đỗ Thị Ngọc Hân, 2006. Chuyển gene gfp (Green Fluorescent Protein) vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phương pháp tiếp hợp ba thành phần. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh.
2. Nguyễn Duy Bình, 2004. Chọn lọc và đánh giá dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens đối kháng với nấm Rhizoctonia solani gây hại trên cây bông vải. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Nông Học, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh.
3. Nguyễn Trọng Thể, 2004. Chọn lọc và sử dụng vi khuẩn đối kháng Pseudomonas fluorescens để phòng trừ bệnh do nấm Rhizoctonia solani và Sclerotium rolfsii gây hại trên cây bông vải và cây cà chua. Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh. 4. Phạm Duy, Huỳnh Văn Thái, 2005. Xây dựng quy trình biến nạp đoạn
DNA vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Công Nghệ Sinh Học. Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh.
5. Phạm Mỹ Liên, 2004. Chọn lọc và đánh giá dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens đối kháng với nấm Sclerotium rolfsii gây bệnh trên cây cà chua. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Nông Học, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh.
Tài liệu tiếng Anh
1. Bloemberg, G. V., G. A. O’Toole, B. J. J. Lugtenberg, and R. Kolter. 1997. Green Fluorescent Protein as a marker for Pseudomonas spp..
Applied and Environmental Microbiology. 63: 4543-4551.
2. Brown, T. A. 1995. Gene cloning: an introduction, 3rd ed. Chapman and Hall, London, UK.
49
3. Cameron, L. 2007. Recombinant DNA technology. Mbio 4570 Laboratory, 201 Buller Bldg, Canada.
4. de Lorenzo,V. , M. Herrero, U. Jakubzik, and K. N. Timmis. 1990. Mini- Tn5 transposon derivatives for insertion mutagenesis, promoter probing, and chromosomal insertion of cloned DNA in gram-negative eubacteria.
J. Bacteriol. 172: 6568-6572.
5. Finan,T.M., B. Kunkel, G.F. de Vos, and E.R. Signer. 1986. Second symbiotic megaplasmid in Rhizobium meliloti carrying exopolysaccharide and thiamine synthesis genes. J. Bacteriol. 167: 66-72. 6. Grall, S. and C. Manceau. 2003. Colonization of Vitis vinifera by a Green Fluorescence Protein-Labeled, gfp-Marked Strain of Xylophilus ampelinus, the Causal Agent of Bacterial Necrosis of Grapevine. Applied and Environmental Microbiology. 69(4): 1904–1912.
7. Mayer, G. 2007. Exchange of genetic information. In Microbiology and
Immunology On-line, Hunt, R.C. editor.
http://pathmicro.med.sc.edu/mayer/genetic%20ex.htm. University of South Carolina School of Medicine.
8. Mergeay, M., and J. Gerits. 1978. F'-Plasmid Transfer from Escherichia coli to Pseudomonas fluorescens. J. Bacteriology. 135: 18-28.
9. Mølbak, L. 2003. Conjugative plasmids and the transfer of mobile genetic elements among bacteria in plant rhizosphere environments. PhDs thesis. National Environmental Research Institute, Denmark. 142 pp.
10.Royston,C. 1972. Molecular structure of bacterial plasmids.
Bacteriological Reviews. 36: 361-405.
11.Sawada,H., H. Ieki, and I. Matsuda. 1995. PCR detection of Ti and Ri plasmids from phytopathogenic Agrobacterium strains. Applied and Environmental Microbiology. 61: 828-831.
50
12.Sepúlveda-Torres, L. D. C., N. Rajendran, M. J. Dybas, C. S. Criddle. 1999. Generation and initial characterization of Pseudomonas stutzeri KC mutants with impaired ability to degrade carbon tetrachloride. Arch Microbiol. 171: 424-429.
13.Smith, A. W., and B. H. Iglewsski. 1989. Transformation of
Pseudomonas aeruginosa by electroporation. Nucleic Acids Res. 17: 10509.
51
PHỤ LỤC
Công thức pha một số môi trƣờng dùng trong thí nghiệm Môi trƣờng LB (Luria – Bertain) lỏng
Tryptone 10g Bacto yeast extract 5g
NaCl 10g
Thêm nƣớc cho tới 1000ml
Chuẩn độ pH=7.0 bằng NaOH 1N Hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút
Môi trƣờng KB (King’s B) agar
Proteose peptone 20g Glycerol 15ml K2HPO4 1.5g MgSO4.7H2O 1.5g Thêm nƣớc cho tới 1000ml
Chuẩn độ pH=7.2 bằng NaOH 1N Agar 15g Hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút Môi trƣờng M9 Na2HPO4.7H2O 6g KH2PO4 3g NaCl 0.5g NH4Cl 1g Thêm 950ml nƣớc Chuẩn độ pH=7.4 bằng NaOH 1N
52
Bacto agar 15g
Hấp khử trùng 1210C trong 20 phút, để nhiệt độ hạ xuống 600C thêm 10ml Glucose 20% đã đƣợc lọc
1ml CaCl2 0.1M đã hấp khử trùng 1ml MgSO4 1M đã hấp khử trùng 50 µl Thiamine 100 µg/ml đã đƣợc lọc Thêm nƣớc tới 1000ml
Các dung dịch stock kháng sinh
Pha các dung dịch stock có nồng độ 100µg/µl
Cân 100 mg kháng sinh Ampicillin cho vào 1ml nƣớc hấp vô trùng trong eppendorf 1,5 ml, trộn đều rồi lọc qua đầu lọc 0.22 µm. Dung dịch kháng sinh đƣợc chiết ra các eppendorf 200µl. Cất ống eppendorf dùng thƣờng vào tủ mát 50C, các ống còn lại bảo quản trong tủ -200C, tất cả các ôngg đều đƣợc bọc giấy bạc và bảo quản trong tối.
Pha tƣơng tự cho Kanamycin. Còn Chloramphenicol cũng đƣợc pha tƣơng tự nhƣng thay nƣớc bằng ethanol nguyên chất.
Vật liệu dùng để xem kính hiển vi
Lam
Lame
Dầu soi kính Giấy lau kính
Bảng xử lý số liệu thống kê theo phần mềm MINITAB Release 13.2 One-way ANOVA: Số khuẩn lạc theo Thời gian
Analysis of Variance for So khuan
Source DF SS MS F P Thoi gia 2 78091 39045 6,62 0,030 Error 6 35413 5902
53
Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev
Level N Mean StDev ---+---+---+---+
