Đồng nhất mẫu
Cho khoảng 0,1 g cơ vân vào eppendorf 1,5 ml. Dùng chày nghiền nhuyễn mẫu. Phân giải tế bào
Cho vào 60 µl dung dịch đệm tách chiết (50 mM Tris-HCl, 20 mM NaCl, 1mM EDTA và 1% SDS, PH= 8 ) và 3 µl proteinase K (20 mg/ml). Ủ hỗn hợp ở 55o
C trong 1 giờ.
– Tủa protein
Cho vào 375 µl sodium acetate 0,2 M; vortex trong 10 giây. Cho vào 200 µl hỗn hợp phenol / chloroform / isomyl alcohol (25:24:1); vortex nhẹ; ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10o
C. Tủa DNA lần 1
Lấy phần nƣớc nổi bên trên chuyển vào tube 1,5 ml mới, sau đó cho thêm 1ml ethanol tuyệt đối lạnh; trộn đều; ủ -20oC trong 2 giờ.
Ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10oC; lấy cặn làm ráo. Tủa DNA lần 2
Cho vào 180 µl TE 1X, vortex , ủ ở 55oC trong 15 phút.
Cho vào 20 µl sodium acetate 2M, trộn đều; tiếp tục cho vào 500 µl ethanol tuyệt đối lạnh; trộn đều; ủ ở - 20oC trong 15 phút. Ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10oC, bỏ phần nổi lấy cặn.
Rửa DNA
Rửa cặn bằng 1ml ethanol 70%, ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10oC, lấy cặn.
Làm khô cặn trong tủ ấm ở 55oC, quan sát mức độ khô của cặn. Hòa tan DNA
Hòa tan cặn bằng 200 µl TE 1X; ủ 55oC qua đêm; vortex nhẹ cho tan cặn .
Sản phẩm DNA sau khi tách chiết đƣợc trữ ở -20oC hoặc sử dụng ngay. DNA đƣợc kiểm tra độ tinh sạch bằng cách đo mật độ quang (OD: optical density) ở bƣớc sóng 260 nm và 280 nm bằng quang phổ kế (model HP 8453). Hàm lƣợng DNA đƣợc ƣớc lƣợng theo công thức DNA (ng/μl) = [62,9*OD260nm – 36*OD280nm]*(độ pha loãng). Mẫu đƣợc pha loãng 10 lần theo tỷ lệ 10 μl DNA gốc với 90 μl H2O cất khi đo OD.
Ký hiệu qui trình tách chiết DNA trên là qui trình I. Dựa theo qui trình I này chúng tôi tiến hành công đoạn tối ƣu hóa qui trình tách chiết DNA và sản xuất thử bộ kit tách chiết DNA.