PHÂN HỒ BỘT NĂNG BẰNG CHẾ PHẨM α-AMYLASE
Theo bảng 4.8 và 4.9, chúng tôi thấy α-amylase thủy phân tốt ở độ pha loãng 400 lần. Vì vậy chúng tôi tiến hành thí nghiệm này với chế phẩm α-amylase pha loãng 400 lần.
Sau khi tiến hành thí nghiệm khảo sát sơ bộ sự thủy phân tinh bột với các thể tích α-amylase pha loãng 400 lần, chúng tôi chọn ra những thể tích thích hợp để thực hiện thí nghiệm này: thể tích α-amylase cho vào 20 g hồ tinh bột năng 10% và 15% là 0,5 ml enzyme; 20 g hồ tinh bột năng 20% là 1,5 ml enzyme. Kết quả ghi nhận ở bảng 4.10, 4.11 và 4.12.
Bảng 4.10. Hiệu suất thu dextrin khi thủy phân bột năng 10%
Thời gian thủy phân (phút) Khối lƣợng dextrin (g) Hiệu suất (%)
10 1,93 ± 0,032 96,5 ± 1,61
20 1,86 ± 0,015 93,17 ± 2,73
30 1,72 ± 0,055 85,83 ± 0,77
1,93 1,86 1,72 1,62 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 10 20 30 40
Thời gian thủy phân (phút)
D e x tr in ( g ) 2,01 2,37 2,03 1,93 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 10 20 30 40
Thời gian thủy phân (phút)
D e x tr in ( g )
Biểu đồ 4.3. Khối lƣợng dextrin thu đƣợc khi thủy phân hồ bột năng 10%
Sau khi thủy phân hết tinh bột, α-amylase sẽ chuyển sang thủy phân
dextrin. Vì vậy, nếu kéo dài thời gian thủy phân lƣợng dextrin thu đƣợc sẽ thấp dần.
Bảng 4.11. Hiệu suất thu dextrin khi thủy phân bột năng 15%
Thời gian thủy phân (phút) Khối lƣợng dextrin (g) Hiệu suất (%)
10 2,01 ± 0,071 67 ± 2,36
20 2,37 ± 0,065 78,89 ± 2,16
30 2 ± 0,081 66,67 ± 2,69
40 1,93 ± 0,069 64,22 ± 2,31
2,25 2,51 2,36 2,30 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 10 20 30 40
Thời gian thủy phân (phút)
D e x tr in ( g )
Bảng 4.12. Hiệu suất thu dextrin khi thủy phân bột năng 20%
Thời gian thủy phân (phút) Khối lƣợng dextrin (g) Hiệu suất (%)
10 2,25 ± 0,072 56,25 ± 1,81
20 2,507 ± 0,086 62,67 ± 2,14
30 2,363 ± 0,102 59,08 ± 2,54
40 2,303 ± 0,064 57,58 ± 1,59
Biểu đồ 4.5. Khối lƣợng dextrin thu đƣợc khi thủy phân hồ bột năng 20%
Đối với hồ bột năng 15% và 20%, do nồng độ tinh bột cao làm cho khả năng thủy phân tinh bột của α-amylase giảm nên hiệu suất thu dextrin không cao. Ở 30 và 40 phút mặc dù lƣợng tinh bột vẫn còn nhiều nhƣng lƣợng dextrin thu đƣợc vẫn không tăng.
Khối lƣợng dextrin thu đƣợc nhiều nhất khi thủy phân bột năng 10% là 1,93 g đạt hiệu suất là 96,5% và thời gian thủy phân là 10 phút (theo bảng 4.10).
Đối với dung dịch bột năng 15%, lƣợng dextrin nhiều nhất là 2,37 g, hiệu suất 78,89% và thời gian thủy phân là 20 phút (theo bảng 4.11).
Dung dịch bột năng 20% có lƣợng dextrin cao nhất là 2,5 g, hiệu suất 62,67% và thời gian thủy phân là 20 phút (theo bảng 4.12).
Chƣơng 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN
- Thời gian nuôi cấy tốt nhất để thu α-amylase từ Bacillus subtilis là 48 giờ. - Tinh sạch sơ bộ dịch chiết α-amylase từ canh trƣờng nuôi cấy bằng cồn 96% tốt hơn (NH4)2SO4 với tỷ lệ cồn 96% thích hợp nhất là 1:3 với hiệu suất thu enzyme theo hoạt độ là 90,84% và gian tủa là 15 phút.
- Nhiệt độ và pH tối ƣu cho hoạt động thủy phân của α-amylase tƣơng ứng là 55oC và 6,0.
- Lƣợng dextrin thu đƣợc cao nhất (1,94 g) đạt hiệu suất 96,83% khi thủy phân bột năng (khoai mì) 10%.
5.2. ĐỀ NGHỊ
- Tối ƣu các điều kiện nuôi trên khay để thu α-amylase có hoạt độ cao hơn. - Tủa enzyme ở nhiều nồng độ cồn khác nhau.
- Xác định lƣợng tinh bột có trong các nguồn tinh bột khảo sát. - Định lƣợng dextrin thật trong chế phẩm dextrin.
- Tách và khảo sát tính chất các phân đoạn dextrin từ sản phẩm dextrin thu đƣợc; nghiên cứu ứng dụng chế phẩm dextrin vào trong chế biến thực phẩm và y dƣợc.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Lâm Thị Kim Châu, Nguyễn Nhƣ Nhứt, 2006. Phương pháp kiểm tra một số enzyme dùng trong chăn nuôi. Giáo trình khoa Sinh Học Bộ môn Sinh Hóa Đại học Khoa Học Tự Nhiên, TP. Hồ Chí Minh, tr. 16 - 17. 2. Lâm Thị Kim Châu, Văn Đức Chín, Ngô Đại Nghiệp, 2004. Thực tập lớn
sinh hóa. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia, TP. Hồ Chí Minh, tr. 36 – 46. 3. Lê Hồng Phú, 2000. Khảo sát qui trình điều chế dextrin từ một số loại
tinh bột bằng sự thủy giải bởi acid HCl. Khóa luận tốt nghiệp Khoa Sinh Học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, TP. Hồ Chí Minh.
4. Lƣơng Đức Phẩm, 1998. Công nghệ vi sinh vật. Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội, tr. 249 – 257.
5. Nguyễn Đức Duy Anh, 2005. Xác định môi trường tối ưu để thu sinh khối và enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus và thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học. Khóa luận tốt nghiệp ngành Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm, TP.Hồ Chí Minh.
6. Nguyễn Đức Lƣợng, 2004. Công nghệ sản xuất mì chính và các sản phẩm lên men cổ truyền. Nhà xuất bản Khoa Học Kỹ Thuật.
7. Nguyễn Quỳnh Nam, 2006. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo và thử đối kháng với Echerichia coli gây bệnh tiêu chảy tr ên heo. Luận văn tốt nghiệp Khoa Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh.
8. Nguyễn Tiến Thắng, 2002. Giáo trình Công nghệ enzyme. Viện Sinh Học Nhiệt Đới, TP. Hồ Chí Minh, tr. 42- 73.
9. Nguyễn Thị Nhƣ Thủy, 2005. Khảo sát các đặc tính của enzyme amylase thu nhận từ hai chủng nấm mốc Aspergillus niger và Aspergillus oryzae. Khóa luận cử nhân khoa học ngành Sinh Hóa, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP. Hồ Chí Minh.
10. Nguyễn Thị Thu Thủy, 2006. Khảo sát khả năng tổng hợp α-amylase và một số điều kiện kỹ thuật ảnh hưởng lên quá trình tăng sinh của Bacillus
sp. Báo cáo thực tập tốt nghiệp ngành Sinh Hóa, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP. Hồ Chí Minh.
11. Nguyễn Xuân Thủy, 2001. Khảo sát qui trình điều chế dextrin từ một số loại tinh bột bằng sự thủy giải bởi enzyme. Khóa luận cử nhân khoa học ngành Sinh Học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, TP. Hồ Chí Minh.
12. Phạm Thị Ánh Hồng, 2003. Kỹ Thuật Sinh Hóa. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh.
13. Trần Đỗ Quyên, 2004. Thu nhận và khảo sát hoạt tính của chế phẩm alpha amylase từ Bacillus subtilis. Báo cáo thực tập tốt nghiệp ngành Sinh Hóa, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP. HCM.
14. Trần Linh Thƣớc, 2005. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong thực phẩm và mỹ phẩm. NXB Giáo Dục, tr. 65 – 71.
Tài liệu tiếng Anh
15. K. Clarkson, B. Jones, R. Bott, B. Bower, G. Chotani, T. Becker, Enzymes: Screening, Expression, Design and Production, Enzymes in Farm Animal Nutrition (Michael R. Bedford, Gary G. Partridge). CABI publishing, OCAB International, 2001, p. 337 – 346.
Tài liệu từ internet
16. Ngô Xuân Mạnh, Võ Nhân Hậu, Nguyễn Thị Tú. Nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho việc thu nhận α-amylase chịu nhiệt từ vi khuẩn Bacillus licheniformis.
< http://www.hau1.edu.vn/tc_khktnn/upload%5CVoNhanHau_kt&cn52005.pdf> 17. Steven J. McWethy, Paul A. Hartman. Purification and Some
Propeerties of an Extracellular Alpha-amylase from Bactriodes amylophilus. Journal of Bacteriology, March. 1977, p. 1537 – 1544. (URL: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=235133)
18. Janusz Kapusniak, Anna Tyflewska. The utilisation of dextrins from the thermolysis of starch with biogenic amino acids by Lactobacillus rhamnosus bacteria. Food, Agriculture & Enviroment Vol 2 (1): 153 – 159. 2004, Science and Technology, WFL Publisher.
19. Hopek M., Ziobro R, Achremowicz B., 2006. Comparison of the effects of microbial a-amylase and scalded flour on bread quality. Acta Sci. Pol, Technol. Aliment .5(1), 97 – 106.
<URL: http://www.food.actapol.net/pud/8_1_2006.pdf>
20. O. S. AZEEZ, 2005. Production of Dextrins from Cassava Starch. Chemical Engineering Department, Federal University of Technology, Minna, Nigeria, Lenardo Journal of Sciences ISSN 1583 – 0233.
<URL: http://ljs.academicdirect.org/A07/09_16.pdf>
21. Dextrin. The Colombia Encylopedia, Sixthedition. Copyright 2001 - 05 Colombia University Press.
<URL:http:// www.bartleby.com/65/de/dextrin.html> 22. Bacillus subtilis
<URL: http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillussubtilis> <URL: http://www.epa.gov/oppt/biotech/pubs/fra/fra009.htm>
PHỤ LỤC
1. THÀNH PHẦN MỘT SỐ LOẠI MÔI TRƢỜNG 1.1. Môi trƣờng nƣớc chiết giá đậu đƣờng pepton agar
Giá đậu 100g D-glucose 50g Pepton 10g Agar 20g Nƣớc cất đủ 1000 ml pH = 7
Đun sôi 100g giá với 1000 ml nƣớc cất trong 30 phút, để nguội. Lọc nƣớc giá bằng vải lọc và định mức lại cho đủ 1000 ml. Cho glucose, pepton, agar vào và đun sôi, khuấy đều. Phân vào từng ống nghiệm, mỗi ống khoảng 10 ml môi trƣờng, hấp khử trùng ở 1atm trong 30 phút. Các ống nghiệm sau khi hấp đƣợc để nghiêng.
1.2. Môi trƣờng nƣớc chiết giá đậu đƣờng pepton
Giá đậu 100g
D-glucose 50g
Pepton 10g
Nƣớc cất đủ 1000 ml
pH = 7
Cho Glucose, pepton vào nƣớc chiết giá, khuấy đều và cho vào các erlen. Hấp khử trùng ở 1atm trong 30 phút.
1.3. Môi trƣờng nuôi cấy bán rắn Bã đậu nành 50g Cám bắp 50g NaCl 0.36g CaCl2 0.6g DAP 0.2g MgSO4 0.5g Nƣớc cất đủ 135 ml pH = 7 2. CÁC PHƢƠNG PHÁP THỰC HIỆN 2.1. Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc
Khác với phƣơng pháp đếm trực tiếp dƣới kính hiển vi, phƣơng pháp đếm khuẩn lạc cho phép xác định số lƣợng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu.
Ƣu điểm của phƣơng pháp này là độ nhạy cao, cho phép định lƣợng vi sinh vật ở mật độ thấp trong mẫu.
Cách thực hiện
- Pha loãng mẫu theo dãy thập phân:
Mẫu đƣợc pha loãng tuần tự thành dãy các nồng độ thập phân: hút 1 ml mẫu (hoặc dung dịch có độ pha loãng trƣớc đó) vào ống nghiệm chứa 9 ml nƣớc cất đã khử trùng, lắc đều.
- Sau khi đã pha loãng thành các nồng độ 10-3,10-4, 10-5, 10-6,… hút 1 ml dịch pha loãng ở mỗi nồng độ cho vào đĩa petri. Đổ khoảng 15 – 20 ml môi trƣờng đã khử trùng và để nguội đến 45 - 50oC vào đĩa petri có mẫu.
- Xoay nhẹ đĩa petri cùng chiều và ngƣợc chiều kim đồng hồ vài lần để dung dịch giống đƣợc trộn đều trong môi trƣờng cấy.
- Đậy nắp đĩa petri, để đông tự nhiên, lật ngƣợc đĩa.
Tính kết quả
Mật độ tế bào vi khuẩn trong mẫu ban đầu tính từ số liệu của độ pha loãng Di đƣợc tính theo công thức:
Mi (CFU/ml) = Ai x Di/V Trong đó: Ai là số khuẩn lạc trung bình /đĩa Di là độ pha loãng
V là dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml).
Mật độ tế bào trung bình MI trong mẫu ban đầu là trung bình cộng của Mi ở các nồng độ pha loãng khác nhau.
2.2. Phƣơng pháp đo độ đục
Nguyên tắc
Khi một pha lỏng có chứa nhiều phần tử không tan thì sẽ hình thành một hệ huyền phù và có độ đục bởi các phần tử hiện diện trong môi trƣờng lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới.
Tế bào vi sinh vật cũng là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trƣờng cũng làm môi trƣờng trở nên đục. Độ đục của huyền phù tỷ lệ với mật độ tế bào.
Tiến hành
- Xây dựng đƣờng tƣơng quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào:
Các huyền phù của vi sinh vật cần kiểm nghiệm đƣợc pha loãng và đo OD610nm đạt các giá trị lân cận 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 và 0,5.
Dùng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc xác định mật độ tế bào (N/ml) của các huyền phù này.
Tính giá trị log(N/ml) cho mỗi giá trị mật độ N/ml tƣơng ứng với mỗi độ đục. Vẽ đƣờng biểu diễn của log(N/ml) (trục tung) theo OD610nm (trục hoành). Xác định khoảng tuyến tính giữa log(N/ml) và OD610nm.
- Xác định mật độ tế bào theo độ đục:
Đo độ đục của huyền phù tế bào cần xác định mật độ
Từ trị số OD610nm đo đƣợc, dựa vào đƣờng tƣơng quan giữa log(N/ml) và độ đục OD610nm suy ra trị số log(N/ml) và trị số mật độ N/ml (N/ml = 10a với a = log(N/ml).
2.3. Phƣơng pháp tinh sạch enzyme bằng cồn
Nguyên tắc
Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong số đó là hằng số điện môi của dung dịch. Nhìn chung, những phân tử có hằng số điện môi lớn (nhƣ nƣớc, dimethylsulphoxid) có thể ổn định các tƣơng tác giữa chúng với các phân tử protein và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hòa tan của protein trong dung dịch. Ngƣợc lại, các dung môi với hằng số điện môi nhỏ (aceton, ethanol…) ngăn cản sự phân tán của các phân tử protein trong môi trƣờng. Do đó, độ hòa tan của những phân tử protein giảm và xảy ra sự kết tủa do sự làm giảm hằng số điện môi hiện hữu của môi trƣờng.
Cách tiến hành
Sau khi cho cồn vào, enzyme sẽ bị kết tủa. Ly tâm loại cồn, thu tủa enzyme. Tủa enzyme đƣợc hòa tan trong dung dịch đệm acetate (pH=5) và đo hoạt tính enzyme bằng phƣơng pháp Heinkel kết hợp với định lƣợng protein bằng phƣơng pháp Lowry.
2.4. Phƣơng pháp tủa enzyme bằng (NH4)2SO4
Nguyên tắc
Ở nồng độ muối cao thì khả năng hòa tan của enzyme giảm mạnh và có xu hƣớng kết lắng vì nồng độ muối cao làm giảm hằng số điện môi của dung dịch, làm protein bị mất nƣớc.
Cách tiến hành
Cân chính xác lƣợng muối (NH4)2SO4 ứng với các nồng độ bão hòa trong 10 ml dịch chiết enzyme (xem bảng 2.1).
Bảng 2.1. Khối lƣợng tƣơng ứng các độ bão hoà
Độ bão hoà
(%) 50 55 60 65 70
(NH4)2SO4
Cho 10 ml dịch chiết enzyme vào erlen và đƣa vào máy khuấy từ, cho từ từ muối vào. Sau 30 phút lấy ra ly tâm.
2.5. Phƣơng pháp Heinkel
Thực hiện
Cho vào ống nghiệm 1 ml dung dịch tinh bột 1%, 1 ml dung dịch NaCl 0,1%, 2 ml dung dịch đệm phosphate 0,05M, pH 6,0. Lắc đều, để ống nghiệm trong tủ ấm ở 30oC, 15 - 20 phút để dung dịch đạt đến 30oC. Thêm 1 ml dung dịch enzyme đã pha loãng và đạt đến 30oC vào ống nghiệm. Lắc đều và tiếp tục giữ ở 30oC trong 30 phút. Lấy ống nghiệm ra khỏi tủ ấm cho ngay vào 5 ml dung dịch HCl 1N để dừng phản ứng.
Song song với mẫu thí nghiệm, làm mẫu kiểm tra đối chứng tƣơng tự nhƣ trên nhƣng cho dung dịch HCl vào trƣớc rồi cho enzyme vào.
Lấy 1 ml mẫu thí nghiệm và đối chứng cho vào ống nghiệm mới, thêm vào 9 ml dung dịch Iod pha loãng 450 lần. Lắc đều, so màu ở bƣớc sóng 560 nm. Lấy hiệu số đọc đƣợc trên máy giữa mẫu đối chứng và thí nghiệm đối chiếu với đƣờng cong tiêu chuẩn, tính số mg tinh bột đã bị thủy phân.
Cách tính
Đơn vị hoạt động của enzyme là lƣợng enzyme có khả năng phân giải 1 mg tinh bột thành các sản phẩm không tạo màu với Iod sau 30 phút ở điều nhiệt độ thí nghiệm.
Hoạt độ A = Số mg tinh bột bị phân giải * Độ pha loãng (UI).
2.6. Phƣơng pháp Lowry định lƣợng protein hòa tan trong nƣớc
Nguyên tắc
Hầu hết các protein đều chứa Tyrosin và Tryptophan. Hàm lƣợng của những amino acid này tùy thuộc vào loại protein. Vì vậy, những protein cùng một loại với nhau có hàm lƣợng các amino acid này giống nhau.
Khi cho protein tác dụng với thuốc thử Folin sẽ tạo thành một phức chất có màu. Cƣờng độ màu của phức này tỷ lệ với hàm lƣợng Tyrosin và Tryptophan
(cũng là lƣợng protein). Vì thế ta có thể dùng phƣơng pháp so màu để xác định hàm lƣợng protein.
Hóa chất
Dung dịch albumin 0,1%: cân chính xác 0,1 g albumin pha với nƣớc cất thành 100 ml.
Dung dịch A: cân 2 g Na2CO3 hòa trong NaOH 0,1N thành 100 ml Dung dịch B: 0,5 g CuSO4.5H2O hòa trong natri citrate 1% thành 100 ml
Dung dịch C: hỗn hợp A và B theo tỉ lệ 49:1. dung dịch C pha trƣớc khi dùng 30 phút.
Thuốc thử Folin: pha loãng 3 lần từ Folin đậm đặc. Cách tiến hành
+ Lập đồ thị chuẩn:
Chuẩn bị dung dịch protein chuẩn có các nồng độ: 0, 50, 100, 150, 200, 250