Bào tử thu được sau khi tách đơn bào tử sẽ phát triển thành khuẩn lạc. Dùng dao cấy cắt 3 mẫu thạch chứa sinh khối nấm (mỗi mẫu kích thước khoảng 9 mm2
) đĩa petri sang bình tam giác để tăng nhanh sinh khối. Các bình tam giác này chứa môi trường nhân sinh khối và được lắc ở 160 vòng/phút, ở nhiệt độ 28 C. Nấm
Hình 4.5 Đại bào tử F.moniliforme
(xem ở vật kính 40X).
Hình 4.6 Tiểu bào tử F.moniliforme
được nhân sinh khối trong môi trường lỏng nhằm tạo điều kiện cho khuẩn lạc nấm tiếp xúc với môi trường nhiều hơn từ đó tăng nhanh sinh khối. Sau khoảng 3 – 4 ngày, khi sinh khối đã đạt được lượng cần thiết ta tiến hành thu sinh khối. Vấn đề thường gặp trong giai đoạn này là rất dễ bị nhiễm khuẩn, đặc biệt là trong ngày thứ nhất và thứ hai. Tuy theo dõi từng ngày trong quá trình lắc nhưng do lắc liên tục nên rất khó phát hiện bị nhiễm khuẩn trong khi lắc. Để đảm bảo không bị nhiễm khuẩn, trước khi thu sinh khối ta tiến hành quan sát kỹ dịch lỏng, thông thường mẫu bị nhiễm khuẩn sẽ bị đục trong khi lắc.
4.4 Kết quả ly trích DNA của nấm
Sợi nấm được thu nhận sau khi nhân sinh khối các dòng nấm và được tiến hành ly trích DNA tổng số theo qui trình 1 nêu ở Mục 3.3.2.2. Kết quả ly trích được thể hiện ở Hình 4.7.
Sản phẩm điện di DNA tổng số ly trích theo qui trình 1 có quá nhiều tạp, do đó chúng tôi đã tiến hành ly trích DNA theo qui trình 2 là thay thế bước xử lý phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1) bằng chloroform/Isoamyl alcohol (24:1) thì hạn chế được lượng DNA đứt gãy (Hình 4.8).
Tạp
Hình 4.7 Kết quả ly trích DNA theo qui trình 1.
Ghi chú: (1) FM1; (2) FM2; (3) FM3; (4) FM4; (5) FM5; (6) FM6; (7) FM7; (8) FM8; (9) FM9; (10) FM10; (11) FM11; (12) FM12; (13) FM13; (14) FM14; (15)
FM15; (16) FM16; (17) FM 17; (18) FM18; (19) FM19; (20) FM20.
Thời gian ở các lần ly tâm của qui trình Lee và Taylor cải tiến 10 – 15 phút do đó đã tăng thời gian để phá hủy lớp vỏ tế bào, lớp màng nhân, loại bỏ protein và cũng giúp cho sự phân lớp giữa phần dịch tế bào chứa DNA, lớp xác tế bào và protein tốt hơn vì vậy loại bỏ được nhiều tạp trong quá trình ly trích mặc dù qui trình này không dùng proteinase K để loại bỏ các protein và RNase để loại bỏ RNA. Bên cạnh đó, phenol có thể làm đứt gãy DNA. Do đó khi tiến hành ly trích với qui trình 2 chúng tôi thu được kết quả tối ưu hơn qui trình 1. Theo Hình 4.8, DNA của các dòng FM12, FM13, FM14, FM17, FM19 có lượng tạp rất ít nên có thể tiến hành
15
12 13 14 16 17 18 19 20
DNA tổng số
Phần tạp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Hình 4.8 Kết quả ly trích DNA của 20 dòng nấm Fusarium moniliforme theo qui trình 2.
chạy PCR sau khi pha loãng 10 lần bằng TE 1X hoặc nước khử ion. DNA của các dòng nấm còn lại do lượng tạp tương đối nhiều nên phải tiến hành tinh sạch lại.
4.5 Kết quả PCR
Theo David và ctv (2004) một trong những trở ngại lớn khi nghiên cứu
Fusarium là việc định danh loài dựa vào hình thái, độc tố hoặc khả năng gây bệnh vì những đặc điểm phân chia loài dựa vào hình thái chưa rõ ràng đồng thời cũng có nhiều biến đổi và đột biến trong quá trình nuôi cấy. Để giải quyết vấn đề này các tác giả trên đã tạo ra Fusarium ID.v.1.0 – dữ liệu trình tự DNA của vùng tef để xác định nhanh và chính xác các nấm tạo độc tố trichothecene loại B và phức hệ loài
Gibberella fujikuroi; Fusarium oxysporum; Fusarium solani.
Vùng gen tef có thể phân biệt được giữa các nhóm với nhau hay giữa loài cùng nhóm. Vùng tef được nghiên cứu nhiều hơn do chứa trình tự DNA đặc trưng cho từng nhóm loài (Trích Lại Hà Tố Hoa, 2006). Đặc biệt đối với Fusarium vùng gen tef mã hóa những protein thiết yếu trong quá trình dịch mã và rất hữu ích để xác định nguồn gốc phát sinh loài. Ngoài ra gen này là bản sao đơn bền vững ở
Fusarium và nó cho mức độ đa hình cao ở các loài có quan hệ gần gũi từ đó tef trở thành công cụ định danh Fusarium dựa trên locus đơn. Trên cơ sở đó chúng tôi sử dụng cặp mồi ef1 và ef2 được thiết kế bởi O‟Donnell và ctv (1998) để khuếch đại vùng gen tef của 20 dòng nấm Fusarium spp. gây bệnh lúa von ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long. Kết quả thu được sản phẩm khuếch đại của 14 dòng nấm có kích thước gần bằng 700 bp rõ và ít tạp. Kết quả này cũng tương tự với nghiên cứu của David và ctv (2004). Bên cạnh đó kết quả PCR (Hình 4.9) cũng cho thấy sản phẩm PCR của các dòng nấm Fusarium moniliforme được thu thập trên các giống lúa ở các tỉnh ĐBSCL đều có kích thước của vùng tef bằng nhau. Hạn chế của đề tài là chúng tôi chưa tiến hành PCR hết tất cả các dòng nấm được phân lập.
4.6 Kết quả định tính GA3 bằng TLC
GAs là nhóm hormon thực vật quan trọng thứ hai sau nhóm auxin do những ứng dụng đa dạng của nó đối với sự sinh trưởng, phát triển và sinh sản của cây trồng như kích thích sự kéo dài của đốt, phá vỡ trạng thái ngủ nghỉ của hạt và xác định phái tính của hoa (Lincoln Taiz và ctv., 2002). Hiện nay, các nhà khoa học đã phát hiện được hơn 136 loại giberelins tiết ra từ vi khuẩn, nấm và thực vật (http://www.plant-hormones.info). Trong đó, nấm Gibberella fujikuroi gây bệnh lúa von sản xuất nhiều GA3.Vì vậy chúng tôi tiến hành nuôi 20 dòng nấm Fusarium moniliforme được phân lập trên môi trường sản xuất GA3 – 20% ICI trong 7 ngày trên máy lắc 200 vòng/phút/28oC (Stefan Malonek và ctv., 2005). Sau đó tiến hành trích GA3 như Mục 3.4.3 rồi thực hiện TLC theo Mục 3.4.4.
Kết quả nuôi 20 dòng nấm Fusarium moniliforme trong môi trường 20% ICI tốt, không bị nhiễm trong quá trình nuôi cấy. Để kiểm tra giới hạn phát hiện GA3 của chuẩn chúng tôi tiến hành TLC chất chuẩn ở các nồng độ 1, 5, 10, 50 và 100 ppm. Kết quả các chuẩn ở nồng độ 1 và 5 ppm thấy không hiện vết khi quan sát dưới đèn UV, còn các chuẩn 10 và 50 ppm thì hiện vết mờ vì thế chúng tôi chọn chuẩn 100 ppm để tiến hành cùng với mẫu. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 4.9 Sản phẩm PCR đƣợc khuếch đại từ DNA của các dòng
Fusarium moniliforme bằng cặp primer ef1-ef2. (1) DNA được khuếch đại từ dòng nấm FM1; (2) FM2; (3) FM3; (4) FM4; (5) FM5; (6) FM7; (7) FM8; (M) ladder; (8) FM9; (9) FM11; (10) FM12; (11) FM14;(12) FM15; (13) FM16; (14) FM18.
Trong 20 mẫu nấm sau khi nuôi cấy, trích GA3 và tiến hành TLC trên hệ dung môi chloroform: ethyl acetate: acid acetic (60:40:5) chúng tôi nghi ngờ 3 dòng nấm FM2, FM5 và FM15 có thể tạo ra GA3 trong môi trường nuôi cấy (Hình 4.10). Các dung dịch nuôi cấy 17 dòng còn lại không hiện vết tại vị trí có Rf tương đương với chuẩn.
Theo Hình 4.10 nhận thấy vết đầu tiên trên bản TLC từ dưới lên của dung dịch nuôi cấy 3 dòng nấm FM2, FM5 và FM15 tương ứng với vị trí số 1, 2, 4 có giá trị Rf tương đương với vết GA3 chuẩn 100 ppm ở vị trí số 3 (Rf=0,12).
Ghi chú: (1); (2); (4) tương ứng là dung dịch nuôi cấy các dòng nấm FM2, FM5 và FM15. (3) chuẩn GA3 100 ppm.
Tuy nhiên chúng tôi tiến hành trên hệ dung môi chloroform:methanol:acid acetic (85:15:5) (Đỗ Thị Di Thiện, 2005) phân cực hơn hệ dung môi cũ nhằm khẳng định Rf của các vết từ dung dịch nấm có tương đương với vết chuẩn GA3 hay không. Kết quả thu được Rf của 3 mẫu thấp hơn Rf của chất chuẩn. Ngoài ra dựa vào Hình 4.10, các vết khác ở các mẫu có thể là các giberelins khác do nấm tiết ra trong quá trình nuôi cấy. Thật vậy, theo tác giả Nguyễn Văn Uyển (1989), dung dịch nuôi cấy một số chủng nấm lúa von Gibberella fujikuroi đã phát hiện sự tồn tại của 25 loại giberelin. Từ những kết quả trên nhận thấy qui trình thực hiện trên 20 dòng nấm không hiệu quả do một số nguyên nhân sau: điều kiện nuôi cấy nấm, qui trình trích GA3 chưa tối ưu và nồng độ GA3 trong dung dịch nuôi cấy nấm quá thấp.
Hình 4.10 Kết quả TLC dịch nấm sau khi nuôi cấy các dòng nấm F.moniliforme
Chƣơng 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận
Đã phân lập và tách đơn bào tử được 20 dòng nấm Fusarium moniliforme
gây bệnh lúa von trên các ruộng lúa ở Đồng Bằng Sông Cửu Long.
Có thể áp dụng qui trình 2 ở Mục 3.3.2.2 để tiến hành ly trích DNA của nấm Fusarium moniliforme.
Qui trình PCR ở mục 3.3.3.2 ổn định cho sản phẩm rõ và không có tạp nên dùng để phân tích PCR trên vùng tef của nấm Fusarium moniliforme. Đã chạy thành công 14/20 dòng nấm được phân lập.
Trong 20 dòng nấm, chưa phát hiện được dòng nào sản xuất GA3 trong môi trường 20% ICI bằng TLC.
5.2 Đề nghị
Tiến hành thí nghiệm chủng nấm in vitro từ đó có thể xác định được dòng nấm có độc tính mạnh nhất có nghĩa là tìm dòng nấm nào tạo nhiều GA3 nhất.
Tiến hành đọc trình tự sản phẩm PCR rồi đem kết quả đọc trình tự so sánh với trình tự trên Genbank để có thể xác định rõ loài gây bệnh.
Tìm điều kiện nuôi cấy thích hợp và quy trình trích giberelin hiệu quả để nấm Gibberella fujikuroi có khả năng sản xuất giberelin.
TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Tài liệu trong nƣớc
1. Phạm Văn Biên, Bùi Cách Tuyến, Nguyễn Mạnh Chinh, 2003. Cẩm nang sâu bệnh gây hại cây trồng, quyển 1, cây lương thực, thực phẩm, hoa cảnh. Nhà xuất bản nông nghiệp. Trang 123 – 125.
2. Bùi Chí Bửu, Ngyễn Thị Lang, 2004. Di truyền phân tử. Nhà xuất bản nông nghiệp. Trang 331 – 348.
3. Nguyễn Xuân Dũng và Phạm Hùng Việt, 1985. Các phương pháp sắc ký. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội. Trang 225 – 297.
4. Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục.
5. Lại Hà Tố Hoa, 2006. Định danh nấm Trichoderma dựa vào trình tự vùng ITS-rDNA và vùng tef.. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
6. Đào Văn Hoằng, 2005. Kỹ thuật tổng hợp các hóa chất bảo vệ thực vật. Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật Hà Nội. Trang 317 – 320.
7. Ngô Quang Hưởng, 2006. “Phân tích đa dạng di truyền của quần thế nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây bệnh trên cây cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) tại Lai Khê (Bến Cát – Bình Dương) bằng kỹ thuật RFLP – PCR”. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
8. Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998. Bệnh cây nông nghiệp. Nhà xuất bản nông nghiệp Hà Nội. Trang 82 – 84.
9. Đỗ Thị Di Thiện, 2005. Khảo sát ảnh hưởng của vi khuẩn Methylobacterium sp. lên sự ảnh hưởng của cây Hông (Paulownia fortunai) và cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L. cv samsum) nuôi cấy invitro. Khóa luận cử nhân khoa học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên.
10.Trần Tùng, 2005. Bệnh hại hạt lúa giống sau khi thu hoạch và ảnh hưởng của biện pháp xử lý thuốc hóa học đến tác nhân gây bệnh, chất lượng hạt giống.
11.Nguyễn Kim Phi Phụng. Các phương pháp nhận danh , trích ly cô lập các hợp chất hữu cơ. Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên 2000 – 2001. Trang 1 – 25. 12.Nguyễn Văn Uyển, 1989. Các chất sinh trưởng trong nông nghiệp. Nhà xuất (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
bản TP.HCM. Trang 18 – 49.
13.Tài liệu qui trình phân tích các hormon thực vật. Phòng Hóa Lý, Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trường, Đại Học Nông Lâm TP.HCM.
2. Tài liệu nƣớc ngoài
14.A.R.Pokalsky, W.R.Hiatt, N.Ridge, R.Rasmussen, C.M.Houck and C.K.Shewmaker, 1989. Structure and expression of elongation factor 1 in tomato.
<http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pubmed&pubmedid =2748335>
15. B.Tudzynski, 1999. Biosynthesis of gibberellins in Gibberella fujikuroi: biomolecular aspects. Appl Microbiol Biotechnol 52: 298 – 310.
16.David M. Geiser, María del Mar Jiménez-Gasco, Seogchan Kang, Izabela Makalowska, Narayanan Veeraraghavan, Todd J.Ward, Ning Zhang, Gretchen A. Kuldau and Kerry O‟Donnell, 2004. FUSARIUM-ID v. 1.0: A DNA sequence database for identifying Fusarium. European Journal of Plant Pathology 00. 17.Hiroshi Harada and Antom Lang, 1964. Effect of some (2-Chloroethyl)
trimethylammonium chloride analogs and other growth retardants on gibberellin biosynthesis in Fusarium moniliforme.
18.Hiroshi Kawaide. Biochemical and molecular analyses of gibberellin biosynthesis in fungi.<www.aseanbiodiversity.info/scripts/count_article.asp?Article
_code=51006656>
19. Kamel A. Abd-Elsalam, Ibrahim N. Aly, Mohmed A. Abdel-Satar, Mohmed S. Khalil and Joseph A. Verreet, 2003. PCR identification of Fusarium genus based on nuclear ribosomal-DNA sequence data. Africa journal of iotechnology vol.2. p82 – 85 .
20. Kurt Weising, Hilde Nybom, Kirsten wolff and Wieland Meyer, 1995. DNA fingerprinting in plants and fungi.CRC Press. 322 pages.
21.Lester W. Burgess, Brett A. Summerell, Suzanne Bullock, Kathryn P. Gott, and David Backhouse, 1994. Laboratory manual for Fusarium research. 3rd edition. University of Sydney.
22.Lincoln Taiz and Eduardo Zeiger, 2002. Plant Physiology. 3rd edition. p509 – 540. 23.MacMillan. J and Suter. P.J, 1963. Thin layer chromatography of the gibberellins.
Nature 197: 790.
24.Paul E. Nelson, 1992. Taxonomy and biology of Fusarium moniliforme.
Mycopathologia 117: 29 – 36.
25. Reyes Candau, Javier Avalos and Enrique Cerdá-Olmedo, 1992. Regulation of gibberellin biosynthesis in Gibberella fujikuroi. Plant Physiol 100: 1184 – 1188. 26.S.H.Ou, 1985.Rice diseases. Second edition. Commonwealth mycological institute.
p262 – 272.
27.Stefan Malonek, Christiane Bomke, Erich Bornberg-Bauer, María C. Rojas, Peter Hedden, Paul Hopkins, Bettina Tudzynski, 2005. Distribution of gibberellin biosynthesis genes and gibberellin production in the Gibberella fujikuroi species complex. Phytochemistry 66: 1296 – 1331.
3. Tài liệu internet
28.http://en.wikipedia.org/wiki/Gibberellic_cid. 29.http://www.ctu.edu.vn/coursewares/khoahoc/sinhhocdc_a2/phan1/ch3.htm#II.2. 30.http://beta.uniprot.org/taxonomy/5127. 31.http://www.knowledgebank.irri.org/riceDoctor_MX/projectImages/image1.gif. 32.http://www.planthealthaustralia.com.au/project_documents/uploads/review4.pdf. 33.http://www.wellesley.edu/Chemistry/chem211lab/Orgo_Lab_Manual/Appendix/ Techniques/TLC/thin_layer_chrom.html. 34.http://www.plantsciences.ucdavis.edu/uccerice/NEWS/RiceNL_mar2003.pdf. 35.http://www.laodong.com.vn/Home/kinhte/2007/2/23593.laodong.
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Bình sắc ký
Phụ lục 2: Công thức tính Rf
Trong đó:
a: Khoảng đường di chuyển của dung môi. b: Khoảng đường di chuyển của hợp chất.