4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1.4 Tỷ lệ nhiễm TMV trên thuốc lá tại huyện Tân Biên và Bến Cầu
Bảng 4.4 Kết quả ELISA đối với TMV trên thuốc lá
Huyện Số mẫu (+) Số mẫu điều tra Tỷ lệ nhiễm (%)
Tân Biên 18 26 69,2
Bến Cầu 11 16 68,8
Chú thích: (+): Dương tính
Biểu đồ 4.3 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm TMV giữa Tân Biên và Bến Cầu
Các số liệu từ Bảng 4.4 và Biểu đồ 4.3 đã cho thấy: Tại huyện Tân Biên, thuốc lá nhiễm TMV khá cao (69,2%) và tại huyện Bến Cầu, tỷ lệ này cũng khá cao (68,8%). Khi so sánh tỷ lệ thuốc lá bệnh giữa 2 huyện, ta nhận thấy rằng tỷ lệ này là tương đương nhau.
Tỷ lệ %
TMV chủ yếu tồn tại trong tàn dư thực vật của vụ truớc để lại trên đồng ruộng. Nhưng hiện nay, tại các huyện này, sau khi thuốc lá được thu hoạch xong thì phần thân, rễ còn lại sẽ được giữ làm phân bón cho vụ sau mà không được đốt bỏ. Điều này đã tạo điều kiện cho TMV phát triển trở lại và tiếp tục gây bệnh cho vụ trồng kế tiếp.
TMV nằm trong xác cặn bã thực vật sẽ bị phân hủy ngoài tự nhiên trong vòng từ 5 đến 6 tháng do thời tiết. Tuy nhiên, vì Tây Ninh là một địa bàn chuyên canh trồng thuốc lá ở nước ta nên các vụ mùa được trồng liên tục, kế tiếp nhau, không có thời gian nghỉ giữa 2 vụ. Do đó, cây thuốc lá nhiễm bệnh từ vụ này sang vụ khác, năm này sang năm khác mà không thể khắc phục được.
Tỷ lệ nhiễm TMV khá cao tương đương nhau tại huyện Tân Biên và Bến Cầu cũng còn do sự lưu thông giữa những vùng trồng thuốc lá trong tỉnh. Những đoàn xe vận chuyển thuốc lá nguyên liệu trong quá trình di chuyển từ vùng này sang vùng kia, đồng thời cũng mang TMV trên những lá thuốc còn sót lại hay trên những vật dụng có liên quan theo và góp phần phát tán bệnh.
Ngoài ra, thuốc lá thường xuyên nhiễm CMV, TMV trong suốt mùa vụ và từ năm này sang năm khác còn vì lý do khách quan sau:
Tây Ninh là vùng trồng thuốc lá phổ biến với diện tích lớn, nhưng chủ yếu việc trồng trọt diễn ra ở những hộ gia đình, tập quán của người nông dân là thường trồng những loại cây như bầu bí, dưa, thơm hay vài loại hoa làm cảnh, đây chính là những cây ký chủ của CMV và TMV. Đồng thời luôn tìm thấy dạng khảm trên các cây trồng này quanh năm. Nên khi các cây này đã nhiễm virus thì nó dễ dàng và nhanh chóng phát tán sang thuốc lá.
Khi trong vườn thuốc lá xuất hiện cây bị bệnh, nhưng vì lý do kinh tế, mà người nông dân thường vẫn tiếp tục trồng những cây này, mà không tỉa bỏ, vì thế từ một vài cây bệnh ban đầu đã mau chóng lan sang các cây khác.
4.1.5 Tỷ lệ thuốc lá chỉ nhiễm CMV hay chỉ nhiễm TMV hay nhiễm hỗn hợp CMV và TMV trên số mẫu thu thập đƣợc
Bảng 4.5 Kết quả ELISA đối với mẫu thuốc lá nhiễm hỗn hợp CMV và TMV và các mẫu chỉ nhiễm CMV hay TMV
Tác nhân gây bệnh Số mẫu (+) Tổng số mẫu điều tra Tỷ lệ nhiễm (%)
Chỉ nhiễm CMV 0 42 0 Chỉ nhiễm TMV 20 47,6 Nhiễm CMV và TMV 11 26,2 Chú thích: (+): Dương tính 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Chỉ nhiễm CMV Nhiễm CMV và TMV Chỉ nhiễm TMV Mẫu dương tính
Biểu đồ 4.4 Tỷ lệ giữa các mẫu thuốc lá nhiễm hỗn hợp TMV và CMV và các mẫu chỉ nhiễm CMV hay TMV
Theo kết quả từ Bảng 4.5 và Biểu đồ 4.4, số mẫu thuốc lá chỉ nhiễm TMV chiếm tỷ lệ cao nhất là 47,6%. Số mẫu nhiễm hỗn hợp CMV và TMV là 26,2%, nhưng không có mẫu nào nhiễm CMV mà không nhiễm TMV. Điều này cũng có nghĩa là tất cả các mẫu điều tra lúc này đều bị nhiễm TMV. Như vậy, có thể nói rằng TMV đang là virus gây bệnh chủ yếu cho thuốc lá ở Tân Biên và Bến Cầu vào thời điểm khảo sát.
Tỷ lệ %
0 10 20 30 40 50 60 70 80 TC1 TC2 TC3 Mẫu dương tính 4.1.6 Tỷ lệ bệnh theo triệu chứng quan sát đƣợc trên cây thuốc lá
Sau khi so sánh kết quả chẩn đoán bằng phương pháp ELISA và triệu chứng trên lá cây thuốc lá quan sát được trên đồng ruộng, tỷ lệ thuốc lá nhiễm bệnh được thể hiện qua Bảng 4.6 và Biểu đồ 4.5.
Bảng 4.6 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm bệnh theo triệu chứng quan sát đƣợc trên lá
Triệu chứng Số mẫu (+) Số mẫu điều tra Tỷ lệ nhiễm (%) Lá dày, phồng rộp (TC1) 2 8 25 Lá có khảm xanh – vàng (TC2) 55 70 78,6 Lá khảm nặng, hoại tử (TC3) 10 25 40 Chú thích: (+) : Dương tính TC1: Triệu chứng 1 [Hình 4.12 (D) và 4.13 (B)] TC2: Triệu chứng 2 [Hình 4.12 (C)] TC3: Triệu chứng 3 [Hình 4.13 (C) và 4.13 (D)]
Biểu đồ 4.5 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm bệnh theo triệu chứng
Từ tỷ lệ này có thể cho phép nhận định: Các lá thuốc lá có triệu chứng khảm xanh – vàng (TC2) có khả năng nhiễm CMV và TMV (78,6%) khá cao.
Một số cây thuốc lá có biểu hiện triệu chứng khác như: Cây lùn, còi cọc hơn so với các cây khác (tất cả được trồng cùng lúc và trong điều kiện canh tác như nhau) như trong Hình 4.13 (E). Nhưng trên lá của tất cả các cây có sự thay đổi hình thái vừa nêu trên đều mang một hay tất cả các triệu chứng đã xét trong Bảng 4.6. Vì vậy, có thể nói
Tỷ lệ
%
việc thu thập mẫu thuốc lá nhiễm CMV, TMV dựa vào triệu chứng biểu hiện trên lá cây sẽ dễ dàng hơn là thu thập theo các triệu chứng khác.
Bên cạnh đó, cũng có một số cây thuốc lá có mang các triệu chứng như trên, nhưng lại không cho kết quả dương tính khi tiến hành kiểm tra bằng kỹ thuật ELISA. Điều này, một lần nữa cũng khẳng định rằng việc xác định cây nhiễm virus mà chỉ dựa vào triệu chứng biểu hiện là không hoàn toàn chính xác.
Trong quá trình điều tra, thu thập mẫu, chúng tôi thấy có triệu chứng cong ngọn trên cây thuốc lá, là triệu chứng đặc trưng do TSWV gây ra. Tuy nhiên, những mẫu này, sau khi dùng kỹ thuật ELISA để chẩn đoán đã không cho kết quả dương tính. Có lẽ, đó là do số lượng của TSWV quá ít, không đủ để biểu hiện thành phản ứng dương tính.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi chưa xác định được tỷ lệ nhiễm bệnh của từng giống thuốc lá. Vì bà con nông dân ở đây đa số chỉ biết là mua giống tại công ty nào thôi, hầu như không quan tâm đến giống của cây thuốc lá đang trồng là gì.
Một lý do nữa, là do chưa có điều kiện để đánh giá tình trạng nhiễm CMV, TMV và TSWV trên các cây thuốc lá được trồng trong nhà lưới (ngăn cách bọ trĩ, rệp thuốc lá mang virus tới lây nhiễm cho cây) và các cây thuốc lá được trồng trong vườn của Tổng Công ty Thuốc lá tại tỉnh Tây Ninh, nên nghiên cứu này chỉ được thực hiện trên những cánh đồng trồng thuốc lá của các hộ gia đình. Vì thế, chúng tôi chưa khảo sát được tỷ lệ nhiễm virus của thuốc lá khi trồng ngoài tự nhiên và khi trồng trong điều kiện cách ly với côn trùng môi giới truyền bệnh.
(A) (B)
(C) (D)
Hình 4.12: Hình chụp cây thuốc lá khỏe và bệnh tại huyện Bến Cầu (2006) (A): Cây thuốc lá khỏe
(A) (B)
(C) (D)
(E) (F)
(B), (C), (D), (E), (F): Triệu chứng cây nhiễm virus CMV và TMV
Hình 4.13: Hình chụp cây thuốc lá khỏe và bệnh tại huyện Tân Biên (2006) (A): Cây thuốc lá khỏe
4.2 Kết quả RT – PCR
Sau khi có kết quả chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA, chọn những mẫu dương tính mạnh với TMV tiến hành chẩn đoán bằng kỹ thuật RT – PCR.
Tiến hành ly trích RNA tổng số (80 µl) từ lá thuốc lá bằng kit ly trích AurumTM Total RNA Mini Kit do Bio – Rad cung cấp.
Thực hiện phản ứng tổng hợp cDNA (20 µl) với bộ kit iScriptTM cDNA Synthesis Kit cũng do Bio – Rad cung cấp.
Kết quả RT – PCR thu được có thành phần hóa chất và chu trình nhiệt như sau: Bước 1: Tổng hợp cDNA
Thành phần hóa chất:
5X iScript Reaction Mix 4 μl iScript Reverse Transcriptase 1 μl
Nuclease free water 13 μl
RNA tổng số 2 μl Tổng thể tích 20 μl Chu trình nhiệt: 5 phút 25oC 40 phút 42oC 5 phút 85oC Giữ ở 4oC
Bước 2: Khuếch đại cDNA bằng PCR
Thể tích Nồng độ cuối
iTaq buffer 10X 5 μl 1 X
MgCl2 2,5 μl 2,5 mM
dNTP 1μl 200 µM
iTaq DNA polymerase 0,5 μl 0,5 μl
primer F 1 µl 0,4 μM
primer R 1 µl 0,4 μM
Nuclease free water 34 µl cDNA 5µl
Chu trình nhiệt: 1 chu kỳ 3 phút ở 94o C 35 chu kỳ 1 phút ở 94o C 1 phút ở 57oC 1 phút 15 giây ở 72o C 1 chu kỳ 7 phút ở 72oC Giữ ở 4oC trong 10 phút. Đổ gel điện di sản phẩm PCR
Gel agarose có nồng độ 1,5%, tiến hành điện di với hiệu điện thế 50 V, cường độ dòng điện 245 mA, trong vòng 60 phút.
Ngâm trong EtBr trong vòng 20 phút.
Kết quả điện di
Hình 4.14 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên thuốc lá nhiễm TMV tại huyện Tân Biên
La : Thang chuẩn 1000 bp
1, 2, 3 : Sản phẩm PCR 3 mẫu 22, 26, 42
Sản phẩm PCR trên Hình 4.14 có kích thước khoảng 1000 bp.
Hình 4.15 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên thuốc lá nhiễm TMV tại huyện Bến Cầu
La : Thang chuẩn 1000 bp
4, 5, 6 : Sản phẩm PCR 3 mẫu 53, 54, 62
Sản phẩm PCR trên Hình 4.15 có kích thước khoảng 1000 bp.
Kết quả điện di trên Hình 4.14 và Hình 4.15 đã cho thấy các sản phẩm PCR thu được đều có kích thước khoảng 1000 bp thay vì là 921 bp. Tuy kết quả này không đúng với lý thuyết nhưng các sản phẩm này có kích thước khá gần với kích thước lý thuyết.
Các mẫu 22, 26, 42 (thu thập tại huyện Tân Biên) và các mẫu 53, 54, 62 (thu thập tại huyện Bến Cầu) là những mẫu cho kết quả dương tính với TMV rõ nhất trong chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA. Các mẫu này sau khi tiến hành RT – PCR thì các sản phẩm PCR thu được đều có kích thước khoảng 1000 bp.
Năm 2005, Lâm Ngọc Hạnh, Đại học Nông lâm TP Hồ Chí Minh đã tiến hành chẩn đoán TMV trên cây cà chua của tỉnh Lâm Đồng cũng bằng phương pháp RT – PCR., với cùng cặp mồi đang sử dụng. Kết quả sản phẩm PCR thu được cũng có kích thước khoảng 1000 bp.
Điều này có thể chứng minh được rằng:
Có sự hiện diện của TMV trong các mẫu thuốc lá thu thập được.
Thuốc lá tại 2 huyện Tân Biên và Bến Cầu của tỉnh Tây Ninh nhiễm cùng môt dòng TMV.
Như vậy, bước đầu có thể kết luận, tại Việt Nam, cà chua và thuốc lá đã nhiễm cùng một dòng TMV.
Tuy nhiên, dòng virus này lại có khác biệt với dòng virus được dùng để thiết kế cặp mồi. Vậy câu hỏi đặt ra là: Dòng TMV tại Việt Nam đã biến đổi như thế nào so với các dòng virus khác? Phải chăng đó là do cặp primer này thiết kế dựa trên dòng TMV của Trung Quốc, nó sẽ khuếch đại đoạn có kích thước là 921 bp đối với TMV nhiễm trên cây bệnh ở Trung Quốc. Nhưng sản phẩm PCR thu được có kích thước khoảng 1000 bp, điều này có thể giải thích là dòng TMV tại Việt Nam đã có biến đổi trong cấu trúc. Sự biến đổi này xảy ra là do sự thay đổi về địa lý, khí hậu giữa 2 nước, nên TMV đã biến đổi cho phù hợp với điều kiện ngoại cảnh Việt Nam.
Trong nghiên cứu này, vì chưa có điều kiện chẩn đoán TMV gây bệnh trên các loài cây khác và chưa giải trình tự đoạn sản phẩm PCR thu được nên chúng tôi chưa trả lời được chính xác câu hỏi trên.
Phần 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 Kết luận
Sau khi tiến hành chẩn đoán TMV, CMV và TSWV trên các mẫu thuốc lá và đậu phộng tại 3 huyện Tân Biên, Bến Cầu, Dương Minh Châu thuộc tỉnh Tây Ninh, chúng tôi thu được kết quả sau:
Thuốc lá và đậu phộng tại địa bàn điều tra, vào thời điểm điều tra, chưa có biểu hiện của việc nhiễm TSWV.
Dịch bệnh virus trên thuốc lá tại tỉnh Tây Ninh vào thời điểm nghiên cứu chủ yếu là do TMV gây nên (69,1%).
Thuốc lá trồng tại huyện Tân Biên có tỷ lệ nhiễm CMV (60,6%) và TMV (69,2%) khá cao.
Thuốc lá trồng tại huyện Bến Cầu nhiễm TMV là chủ yếu (68,8%).
Bước đầu chẩn đoán được sự hiện diện của TMV trên thuốc lá trồng tại tỉnh Tây Ninh bằng kỹ thuật RT – PCR.
5.2 Đề nghị
Với những trở ngại và nghi vấn trong quá trình nghiên cứu bệnh virus trên thuốc lá và đậu phộng, chúng tôi có một số đề nghị sau:
Tiếp tục theo dõi mức độ nhiễm TSWV trên cây thuốc lá và đậu phộng tại những thời điểm khác nhau và những vùng khác nhau tại tỉnh Tây Ninh.
Nghiên cứu thêm về mức độ lây nhiễm, điều kiện phát triển, biện pháp phòng trừ của bệnh TMV, CMV và TSWV trên cây thuốc lá và đậu phộng nhằm hạn chế thiệt hại khi dịch bệnh xảy ra.
Tiến hành ly trích thu RNA bằng phương pháp siêu ly tâm trong khuynh độ đường để so sánh với quy trình ly trích bằng kit.
Thực hiện việc chẩn đoán TMV bằng kỹ thuật RT – PCR trên các loại cây khác, cũng là ký chủ của TMV, góp phần xác định rõ dòng TMV tại Việt Nam.
Giải trình tự đoạn sản phẩm PCR trên để bổ sung vào ngân hàng dữ liệu gen của virus ở Việt Nam và hỗ trợ cho những nghiên cứu sâu hơn.
Phần 6
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Ngọc Bích, 2003. Bước đầu nghiên cứu một số bệnh virus chính trên vùng
thuốc lá tỉnh Tây Ninh. Luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp, Đại học Nông lâm
TP. Hồ Chí Minh.
2. Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2005. Sinh học phân tử, tái bản lần thứ 4. Nhà xuất bản giáo dục, trang 190 – 198, 200 – 206.
3. Lâm Ngọc Hạnh, 2005. Đánh giá tình trạng nhiễm bệnh virus (Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus và Tomato Spotted Wilt Virus) trên cà chua ở tỉnh Lâm Đồng bằng kỹ thuật ELISA và bước đầu xây dựng quá trình chẩn đoán Tobacco
Mosaic Virus bằng kỹ thuật RT – PCR. Khóa luận tốt nghiệp Ngành Công nghệ sinh
học, Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh.
4. Vũ Công Hậu, Ngô Thế Dân, Trần Thị Dung, 1995. Cây lạc. Nhà xuất bản Nông nghiệp, trang 199 – 223, 318 – 368.
5. Phạm Hoàng Hộ, 1993. Cây cỏ Việt Nam. Nhà xuất bản Trẻ, cuốn 2, tập 2, trang 968.
6. PGS. TS. Nguyễn Thị Lang, GS. TS. Bùi Chí Bửu, 2005. Sinh học phân tử. Giới
thiệuvà ứng dụng. Nhà xuất bản Nông nghiệp TP. Hồ Chí Minh, trang 87 – 98.
7. ThS. Võ Thị Thu Oanh, 2002. Bệnh cây đại cương. Bộ môn Bảo vệ thực vật. Khoa Nông học. Trường Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh, trang 47 – 53.
8. Lê Đình Thụy, Phạm Kiến Nghiệp, 1996. Thuốc lá – Trồng và chế biến. Nhà xuất bản TP. Hồ Chí Minh, trang 14 – 17, 42 – 48, 77 – 84.
9. Nguyễn Đình Trường, 2005. Nghiên cứu hiện trạng nhiễm bệnh TSWV (Tomato Spotted Wilt Virus) trên cây ớt bằng kỹ thuật ELISA và bước đầu xây dựng phương
pháp chẩn đoán bằng kỹ thuật RT – PCR. Khóa luận tốt nghiệp Ngành Công nghệ sinh
TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI
10. Antigus, M. Lapidot, N. Ganaim, J. Cohen, O. Lachman, M. Pearlsman, B. Raccah and A. Gera, 1997. Biological and Molecular Characterization of Tomato
Spotted WiltVirus in Israel. Phytoparasitica 25 (4), page 319 – 330.
11. John R. Crowther, the International Atomic Agency, Vienna, Australia, 2001.
TheELISA Guidebook, volume 149. Human Press, New Yersey, page 11 – 21.
12. Karen Delahaut, UW – Madison IPM Program, February 2002. Onion thrips. University of Wisconsin – Extension.
13. R. T. V. Fox, School of Plant Sciences, University of Reading, UK, 1993.
Principles of Diagnostic Techniques in Plant Pathology. Cab International,
Wallingford, Oxon OX1KDE UK, page 129 – 138.
14. Natalie P. Goldberg, Extension PlantPathologist, 2005. Tomato Spotted Wilt
Virus. Guide H – 242. Cooperative Extension Service, College of Agriculture and
Home Economic, New Mexico State University.
15. Tom Kucharek et al, March 2002. Tomato Spotted Wilt Virus of Agronomic,
Vegetable and Ornamental Crops. Circ – 0914.