2.6.4.1. Các phƣơng pháp chung
Theo Trần Minh Tâm (2002) để bảo quản kho nơng sản hiện nay cĩ 5 phƣơng pháp chung:
* Bảo quản nơng sản ở trạng thái thống: để khối nơng sản tiếp xúc với mơi trƣờng khơng khí bên ngồi nhằm điều chỉnh nhiệt độ, ẩm độ trong kho một cách kịp thời thích ứng với mơi trƣờng, do đĩ giữ đƣợc ẩm độ và nhiệt độ của khối nơng sản ở trạng thái an tồn.
* Phƣơng pháp bảo quản kín: đình chỉ sự trao đổi khơng khí giữa nơng sản với mơi trƣờng bên ngồi giữ cho khối nơng sản luơn ở trạng thái an tồn. Mặt khác cĩ nghĩa là bảo quản trong điều kiên thiếu oxy, do đĩ hạn chế quá trình hơ hấp của hạt, hạn chế sự phát sinh phát triển của vi sinh vật và cơn trùng phá hại.
* Bảo quản nơng sản ở trạng thái lạnh: nguyên tắc dùng nhiệt độ thấp làm tê liệt các hoạt động của vi sinh vật và cơn trùng
* Bảo quản nơng sản bằng phƣơng pháp hố học: dùng thuốc hố học để bảo quản nơng sản, mục đích kìm hãm những hoạt động của khối nơng sản và tiêu diệt mọi hoạt động của sâu mọt, vi sinh vât, các lồi gặm nhấm. Đây là phƣơng pháp cĩ hiệu
quả cao, ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi với quy mơ lớn.
* Bảo quản trong khí quyển điều chỉnh: bảo quản nơng sản trong khí quyển cĩ điều chỉnh thành phần các chất khí, đồng thời giảm nhiệt độ kho bảo quản nhằm làm chậm các hoạt động sống của nơng sản mà chủ yếu là quá trình hơ hấp.
2.6.4.2. Bảo quản nơng sản bằng phƣơng pháp hố học
Là phƣơng pháp sử dụng các chất hố học, chủ yếu là các chất độc để phịng chống, bao gồm các chế phẩm hố học, các sản phẩm cĩ nguồn gốc thực vật. Hiện nay đây là phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến, thơng dụng, hiệu quả nhất trên thế giới và ở Việt Nam. Cĩ nhiều loại khác nhau, mỗi loại cĩ cơng dụng riêng biệt và tính chất sử dụng cũng khác nhau. Muốn sử dụng tốt và hiệu quả cần phải đạt các yêu cầu sau:
* Hố chất đƣợc dùng phải cĩ độc lực cao ( hiệu quả cao đối với cơn trùng) * Dễ sử dụng và ít nguy hiểm đối với con ngƣời, rất ít hoặc khơng ảnh hƣởng đến chất lƣợng của hạt và sản phẩm trong kho.
* Hố chất đƣợc sử dụng khơng ăn mịn vật liệu xây dựng và các dụng cụ thiết bị trong kho.
* Cĩ tính ổn định cao, khĩ nổ, khĩ cháy, rẻ tiền.
Trong thực tế hiện nay chƣa cĩ loại thuốc nào cĩ thể đáp ứng đầy đủ những yêu cầu trên, nhƣng căn cứ vào tính chất đầu độc và con đƣờng nhiễm độc của thuốc mà ngƣời ta chia các loại thuốc thành 3 loại: chất độc tiếp xúc, chất độc vị độc, chất độc xơng hơi.
Hiện nay các hố chất đƣợc sử dụng phổ biến trong cơng tác bảo quản nơng sản hiện nay là các hố chất xơng hơi do chúng cĩ thể áp dụng cho nhiều đối tƣợng khác nhau, chúng sinh ra khí, khĩi, mù, tác động vào đƣờng hơ hấp làm cơn trùng bị ngạt hoặc bị ngộ độc chết. Ƣu điểm là sát trùng triệt để vì chúng cĩ thể xâm nhập bất cứ chỗ nào trong kho, tuy nhiên nĩ cũng rất nguy hiểm cho ngƣời và gia súc.
2.6.4.3. Một số loại thuốc kiểm sốt cơn trùng kho hiện nay
- Thuốc cĩ nguồn gốc hố học:
Là những loại cĩ độc tính cao, khơng chỉ đối với sâu mọt mà cịn đối với ngƣời và gia súc…Do đĩ khi sử dụng phải tuân thủ quy định cho từng loại thuốc. Một số hố chất xơng hơi thƣờng dùng hiên nay:
tính thẩm thấu mạnh, cĩ độc tính cao đối với cơn trùng và cũng rất nguy hại đối với ngƣời và gia súc. Methyl bromide hiện nay đã bị cấm sử dụng ở nhiều nƣớc do hậu quả phá hủy tầng ozone và đƣợc cơng bố là một trong những tác nhân gây ung thƣ.
* Phosphine: khí, khơng màu, khơng mùi, trong sản xuất cĩ lẫn tạp chất nên cĩ mùi tỏi hay mùi đất đen, tỉ trọng 1,181 gần bằng tỉ trọng khơng khí (dễ thẩm thấu). Phosphine đƣợc coi là thuốc xơng hơi rất độc đối với cơn trùng hại kho, bên cạnh đĩ cũng rất độc cho ngƣời và gia súc. Phosphine tuy ít độc hơn methyl bromide nhƣng sau một thời gian dài sử dụng, hiện nay cũng đang gặp trở ngại do tình trạng kháng thuốc mạnh của nhiều lồi cơn trùng.
- Thuốc cĩ nguồn gốc thảo mộc
Thuốc thảo mộc diệt trừ sâu hại gồm các chất cĩ trong thực vật nhƣ nicotin trong thuốc lá và thuốc lào, rotenone trong rễ cây dây mật, pakyziron trong củ đậu, azadiarchtin trong cây xoan Ấn Độ, artemisinin trong cây thanh hoa vàng (Phạm văn lầm, 2005)
Các chế phẩm cĩ nguồn gốc thảo mộc cũng cĩ tác dụng diệt trừ cơn trùng hại kho nhƣng hiệu lực khơng cao bằng thuốc hố học, tuy nhiên ƣu điểm là ít độc đối với ngƣời và gia súc, khơng ảnh hƣởng xấu tới mơi trƣờng, dễ phân hủy.
2.7. Phƣơng Pháp Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao (HPLC) (Phùng Võ Cẩm Hồng, 2004)
Đây là phƣơng pháp thƣờng sử dụng để định lƣợng hợp chất thứ cấp, trong đĩ cĩ các hoạt chất trích từ cây neem.
2.7.1. Nguyên tắc
Phƣơng pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC - High performance liquid chromatography) dựa trên sự phân bố của chất tan giữa hai chất lỏng khơng trộn lẫn vào nhau khi cho một chất lỏng di chuyển (pha động) qua chất lỏng đứng yên (pha tỉnh). Pha tỉnh bị hấp thụ trên bề mặt chất rắn (chất mang). Thơng thƣờng là dung mơi phân cực, pha động thƣờng là nƣớc hoặc dung mơi hữu cơ. Đơi khi pha tĩnh là những chất lỏng ít phân cực lúc đĩ pha động phải là dung mơi phân cực hơn.
2.7.2. Những yếu tố ảnh hƣởng
* Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu.
* Mơi trƣờng (gây nhiễm thêm hoặc mất mẫu, gây ảnh hƣởng sức khoẻ, gây nhiễm bẩn mơi trƣờng xung quanh).
2.7.3. Ứng dụng
Phƣơng pháp HPLC cĩ khả năng tách các hợp chất đặc thù nhƣ:
* Các hợp chất cao phân tử và ion thuộc các đối tƣợng nghiên cứu y học , sinh học.
* Các hợp chất tự nhiên khơng bền.
* Các hợp chất kém bền nhiệt, các chất dễ nổ.
Ngồi ra phƣơng pháp HPLC cịn cĩ những ƣu điểm hơn sắc kí cổ điển nhƣ tốc độ nhanh, độ tách tốt, độ nhạy cao, cột tách dùng đƣợc nhiều lần, mẫu chất thu lại dễ dàng vì hầu hết các detector khơng phá huỷ mẫu.
Do cĩ nhiều tính năng ƣu việt nên đƣợc ứng dụng phổ biến trong các lĩnh vực: tách các acid nucleic, tách các dƣợc phẩm, tách các steroid, tách các vitamin, tách các chất bảo quản thực phẩm, tách chất bảo vệ thực vật….
2.7.4. Các bộ phận chính của máy HPLC
. 2.222
2.8. Sơ lƣợc về một số chất phụ gia và bảo quản
2.8.1. Các chất chống oxy hố giúp tăng cƣờng bảo quản (Antioxydant)
Các chất chống oxy hĩa phải đảm bảo các điều kiện sau: * Khơng độc.
* Cĩ hoạt tính cao ở nồng độ thấp (0,01 – 0,02 %).
* Nằm ở bề mặt phân cách, cĩ tính kỵ nƣớc khá mạnh, tiếp xúc với khơng khí. * Ổn định với các điều kiện chế biến.
Pha độ ng Hệ thố ng chuyể n dung mơi Hệ thố ng bơ m mẫ u Cộ t Detector Chuẩ n bị mẫ u Hệxử thố lý dững liệ u
Một số antioxydant quan trọng : BHT, BHA, tocopherol, axit ascorbic… Trong đĩ BHT, BHA là những chất chống oxy hố đƣợc sử dụng phổ biến nhất.
BHT (butylated hydroxytoluen) cĩ cơng thức phân tử 2,6 – di – tert – butyl – 4 – methylphenol), là tinh thể màu trắng với mùi khĩ ngửi, khơng hồ tan trong nƣớc và propylene glycol nhƣng hịa tan tốt trong cồn. BHT đƣợc sử dụng nhƣ một tác nhân chống oxy hĩa, do đĩ nĩ đƣợc dùng trong cơng tác bảo quản thực phẩm, mỹ phẩm, dƣợc phẩm, nguyên liệu đĩng gĩi, nĩi chung là những sản phẩm cĩ chứa mỡ hoặc dầu. Ngồi BHT, BHA (butylated hydroxyanisole) cũng cĩ chức năng nhƣ BHT. BHT và BHA đƣợc biết là an tồn cho ngƣời và động vật sử dụng.
2.8.2. Các chất hấp phụ
Những chất hấp phụ thƣờng đƣợc sử dụng là bột talc, cám gạo, silicagel, than hoạt tính…
2.8.2.1. Talc
Talc là 1 loại khống sản, cĩ tên là hydrated magnesium sheet silicate với cơng thức hố học Mg3Si4O10(OH)2. Một tấm talc gồm hàng ngàn phiến cơ bản chồng lên nhau, phiến cơ bản là sự kết hợp của 1 lớp magnesium-oxygen/hydroxyl octahedra kẹp giữa 2 lớp siliconoxygen tetrahedra, mặt ngồi chính của phiến cơ bản này khơng chứa nhĩm hydroxyl hoặc iơn hoạt động, điều này giải thích cho tính kỵ nƣớc và tính trơ của talc. Cĩ nhiều loại talc, tất cả chúng đều mềm, dẹt, kỵ nƣớc, trơ về mặt hĩa học. Trên thực tế talc khơng hịa tan trong nƣớc, tan yếu trong axit và kiềm, khơng gây nổ hay gây cháy. Mặc dù rất ít hoạt động về mặt hố học nhƣng talc lại cĩ một ái lực lớn với các chất hữu cơ.
Talc là một phần quan trọng trong cuộc sống hằng ngày, đá lát đƣờng đi, tạp chí chúng ta đọc, sợi polyme, sơn… là một trong những sản phẩm làm từ talc.
* Trong nơng nghiệp và thực phẩm, talc là tác nhân chống đĩng bánh hiệu quả, chống dính trong thực phẩm (kẹo gum), giúp đánh bĩng gạo, trong quá trình sản xuất dầu oliu, làm tăng sản lƣợng và sự trong của dầu.
* Trong cơng nghệ sản xuất giấy, làm láng bề mặt giấy.
* Sản phẩm chăm sĩc cơ thể, do tính mềm và trơ, talc đƣợc dùng nhƣ phấn xoa cơ thể, ngày nay nĩ đĩng vai trị quan trọng trong sản xuất mỹ phẩm, phấn hồng, phấn mắt, xà bơng…
Chƣơng 3
NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Nội dung nghiên cứu
Chế tạo và thử nghiệm chế phẩm dạng viên nén để phịng trị ngài gạo với hoạt chất chính trích từ hạt neem trồng tại Việt Nam, bao gồm các giai đoạn nghiên cứu nhƣ sau:
* Hồn thiện kỹ thuật ép dầu hạt neem và chiết xuất hoạt chất trong bánh dầu neem bằng ethanol.
* Định lƣợng ba hoạt chất chính trong dầu neem và dịch chiết từ bánh dầu: azadirachtin, salannin, nimbin.
* Tạo chế phẩm dạng viên nén và thử nghiệm chế phẩm trên ngài gạo trong điều kiện phịng thí nghiệm.
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1. Kỹ thuật ép dầu từ nhân hạt neem và chiết xuất hoạt chất sinh học từ bánh dầu neem
Hạt neem thu tại tỉnh Ninh Thuận đƣợc rửa cồn 98o sau đĩ sấy khơ ở nhiệt độ 45 – 50oC. Sau đĩ sử dụng máy tách vỏ để thu nhân hạt. Nhân hạt neem đƣợc ép dầu bằng máy ép chuyên dụng hiệu Komet của Đức (cơng suất 10 kg hạt/ giờ).
Ƣu điểm của máy là giữ nhiệt độ trong quá trình ép chỉ từ 35 – 40oC. Dầu neem sau khi ép đƣợc giữ ở nhiệt độ 5 – 10oC tránh ánh sáng, thêm chất bảo quản BHT 3 % và tween 5 % tạo thành chế phẩm dầu neem thơ, kí hiệu là DN (dầu neem).
Bánh dầu neem (phần bã cịn lại sau khi ép dầu) đƣợc ngâm với ethanol 98o
để tách các hoạt chất cịn lại theo tỉ lệ 1: 4 (bánh dầu : ethanol). Sau 24 giờ, dịch chiết thơ đƣợc loại dung mơi bằng máy cơ quay chân khơng ở nhiệt độ 60oC. Thu nhận dịch chiết và bảo quản nhƣ dầu neem, gọi là chế phẩm dịch chiết bánh dầu, kí hiệu - DCBD
Hình 3.1. Quy trình ép dầu và chiết xuất hoạt chất từ nhân hạt neem
Hạ t neem Tách vỏ V ỏ Nhân hạ t neem Ép dầ u Bánh dầ u Ngâm bánh dầ u Bã neem Cồ n 98o Dị ch chiế t neem thơ Cơ quay chân khơng Cồ n thu hồ i Dị ch chiế t neem (DCBD) Dầ u neem (DN) Cồ n 980 Sấ y 45-500 C Khuấ y, lắ ng, lọ c Chấ t bả o quả n, nhũ hố Chấ t bả o quả n, nhũ hố
3.2.2. Định lƣợng các hoạt chất chính trong dầu neem và dịch chiết từ bánh dầu neem
Theo schneider và Elmer (1987) việc định lƣơng azadirachtin, nimbin và salannin đƣợc tiến hành nhƣ sau:
Mẫu sau khi qua lọc (lỗ lọc = 0,45 µm) đƣợc cho vào ống đựng mẫu cĩ thể tích 1,5 ml, sau đĩ đựng vào khay đựng mẫu trong máy HPLC (hiệu Hewlett Packard 1090, series 1 – liquid chromatography)và
Tiến hành chạy mẫu với các thơng số sau: - Lƣợng mẫu bơm vào cột: 0,5 µl.
- Cột bảo vệ: BondapakTMC18, 125 Aº, 10 µm, 3,9 × 20 mm. - Cột phân tích: BondapakTMC18, 125 Aº, 10 µm, 3,9 × 300 mm. - Dung mơi rửa cột: CH3CN:H2O (55 – 45); tốc độ dịng: 0,5 ml/ phút. - Detector DAD, Bƣớc sĩng 220 nm.
Để xây dựng đƣờng chuẩn của hoạt chất chính cần phân tích, sử dụng azadirachtin chuẩn của cơng ty Sigma (USA), nimbin và salannin chuẩn của cơng ty Trifolio GmbH (Germany).
Kết quả đƣờng chuẩn nhƣ sau:
- Azadirachtin: y = 3,72 x + 34,58; Hệ số tƣơng quan R = 1. - Nimbin: y = 14,49 x + 170,5; Hệ số tƣơng quan R = 0,998. - Salannin: y = 12,634 x + 73,83; Hệ số tƣơng quan R = 1. Trong đĩ: y - diện tích pick, x - nồng độ hoạt chất (ppm).
Định lƣợng hoạt chất trong mẫu thử đƣợc tính tự động nhờ phần mềm chemstation hãng Aligent-technology cho kết quả nồng độ hoạt chất (ppm) cĩ trong mẫu thử.
a b
c d
Hình 3.2. Một số máy mĩc, trang thiết bị
a. Máy tách vỏ
b. Máy cơ quay chân khơng
c. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao d. Máy ép dầu hạt neem (komet - Đức)
3.2.3. Tạo chế phẩm dạng viên nén với hoạt chất chính là dầu neem và dịch chiết bánh dầu. bánh dầu.
Chế phẩm đƣợc tạo thành trên cơ sở phối trộn dầu neem và dịch chiết bánh dầu với chất hấp phụ thích hợp, cĩ bổ sung chất chống oxy hố. Sau đĩ đùng khuơn để tạo hình chế phẩm. Tiến hành khảo sát từng bƣớc để chọn lựa loại nguyên vật liệu và nồng độ thích hợp của chúng trong chế phẩm.
Chất hấp phụ: sử dụng bột talc, cám gạo, silicagel, và than hoạt tính. Từng chất hấp phụ đƣợc trộn riêng với dầu neem và dịch chiết bánh dầu (nồng độ 5 %). Sau khi ép tạo hình, các chế phẩm thơ này đƣợc dùng để xử lý ngài gạo (đƣợc trình bày chi tiết ở mục 2.6.3. phần tổng quan tài liệu). Dựa vào kết quả ấu trùng chết sau 48 giờ, khả
năng pha trộn và tạo hình để tạo ra chất hấp phụ thích hợp.
Chất hỗ trợ thăng hoa: sử dụng tinh dầu thơng, tinh dầu tràm và tinh dầu bạc hà – là những thƣơng phẩm dễ dàng mua ở thị trƣờng. Tinh dầu đƣợc chọn chủ yếu dựa vào kết quả khảo sát sự hao hụt của chúng trong 24 giờ với cùng thể tích ban đầu (10 ml), cùng điều kiện thí nghiệm ( cốc thủy tinh 50 ml, nhiệt độ phịng) và khả năng dẫn dụ ngài gạo lên trên bề mặt.
Thí nghiệm xác định nồng độ tinh dầu thích hợp đƣợc tiến hành trong phạm vi từ 0,25 - 0,5 - 1,0 - 2,0 – 4,0 (%) cũng dựa vào khẳ năng dẫn dụ của chúng đối với ngài gạo.
Chất bảo quản: Sử dụng chất BHT (butylhydroxi toluene) ở nồng độ 3 %.
Hoạt chất chính: dầu neem 10 % phối hợp với dịch chiết bánh dầu ở bốn nồng độ 5 – 10 – 15 – 20 % trên cùng nền chất hấp phụ, tinh dầu, chất bảo quản đã xác định trƣớc đĩ, tạo thành bốn cơng thức chế phẩm.
Hình 3.3. Quá trình tạo chế phẩm viên nén
3.2.4. Phƣơng pháp nhân nuơi ngài gạo trong phịng thí nghiệm
ăn chính là cám gạo, ở điều kiện nhiệt độ phịng, ẩm độ 75 – 85 %. Sau khi vũ hố, những con thành trùng (bƣớm) đực và cái đƣợc cho nhốt riêng trong lồng cĩ lƣới đậy để đẻ trứng. Hằng ngày tiến hành thu trứng và quét trứng thu đƣợc lên một thau cám khác để tạo điều kiện chu trứng nở.
Tiến hành bổ sung cám thƣờng xuyên để ấu trùng cĩ đủ dinh dƣỡng, tăng khả năng vào nhộng.
Hình 3.4. Nhân nuơi ngài gạo trong phịng thí nghiệm
3.2.5. Thử nghiệm sinh học: đánh giá một số tác động cơ bản của 4 chế phẩm đối với ngài gạo. với ngài gạo.
3.2.5.1. Vật liệu
- Ấu trùng ngài gạo ( tuổi 3) nhân nuơi ở phịng thí nghiệm, trong mơi trƣờng cám gạo.
- Lọ nhựa loại 1 lít và gạo sạch. - Ống bắt cặp và thu trứng.