Triệu chứng bệnh

Triệu chứng cây nhiễm TSWV rất đa dạng, tùy theo tuổi cây, điều kiện canh tác, mức độ nhiễm bệnh.

Cây nhiễm TSWV có triệu chứng chung là xuất hiện các vòng tròn đồng tâm, những đốm héo trên lá non do sự hoại tử của các mô, có đốm lấm chấm. Đầu tiên những đốm này có màu vàng, nhƣng sau đó những vùng bị chết sẽ chuyển sang màu nâu đỏ. Khi bị nhiễm virus, cây trồng bị cằn cỗi, còi cọc, chồi phát triển nghiêng về một bên, lá cây nhăn nheo, vặn vẹo, nhƣ bóp nát, thân cây bị uốn cong, ngã, rủ xuống, phát triển bất thƣờng. Cây bị bệnh không phát triển trong nhiều tuần, lá rụng dần và chết.

Cây trồng bị nhiễm bệnh vào giai đoạn đang phát triển thì có thể không ra quả hoặc có quả nhƣng rất nhỏ, có các đốm nhỏ hay các vòng hoại tử hay thể khảm trên vỏ quả, làm năng suất giảm và giảm giá trị cảm quan.

(Nguồn: Ken Pernezny và cộng sự, 2003).

Tuy nhiên, triệu chứng này có thể giống với các bệnh do các virus khác, vi khuẩn, nấm hay stress môi trƣờng gây ra. Vì thế cách chẩn đoán bệnh theo triệu chứng bên ngoài chỉ là cách xác định bệnh nhất thời nên có thể không chính xác

Hình 2.3. Triệu chứng TSWV trên cà chua 2.2.3.9. Khống chế bệnh do TSWV

Hiện nay hai phƣơng pháp chính đƣợc sử dụng là sử dụng cây kháng và chiến lƣợc quản lý nhằm giảm tác hại của TSWV.

 Sử dụng cây kháng

Sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp cho phép thúc đẩy quá trình nhận dạng, chọn lọc và lai tạo cây mới. Những marker phân tử liên kết với tính kháng TSWV đã đƣợc tìm thấy trong những dòng cà chua phát triển từ những dòng lai giữa SW 307 (Brommonschenkel, Tanksley và Cho) và cây kháng TSWV.

Một số giống cà chua lai kháng TSWV sẵn có trên thị trƣờng:

Giống Amelia (HMX – 0800) do công ty Harris Moran Seed cung cấp. Đặc tính của giống này là trái chín khá sớm, trái to, kháng TSWV, tuyến trùng, và 3 nòi nấm Fusarium gây héo. Amelia đƣợc thử nghiệm ở Mountain Horticultural Crops Research Station ở Fletcher trên 3 năm gần đây và cho kết quả tốt.

Giống EX 1405037 do công ty Seminis Seeds cung cấp. Đặc tính của giống này là trái cà chua to, chín hơi trễ. EX 1405037 không cho kết quả tốt nhƣ Amelia ở Mountain Horticultural Crops Research Station ở Fletcher vào năm 2002 vì thời gian chín lâu hơn.

Giống BHN 444 và BNN 640 do Seigers và công ty hạt Seedway cung cấp. Đặc tính của giống BHN 444 là cho trái lớn nhƣng hình dạng trái hơi thô, giống BHN 640 có tính kháng với ba nòi nấm Fusarium gây héo và kháng TSWV và trái của nó nhỏ hơn nhƣng bóng hơn BHN 444.

 Chiến lƣợc quản lý TSWV

Hiểu biết rõ về mối quan hệ giữa kí chủ – ký sinh – vectơ đã giúp chúng ta phát triển những biện pháp canh tác nhằm làm giảm đáng kể thiệt hại do TSWV gây ra trên những cây trồng nhạy cảm. Nếu sử dụng riêng lẻ từng biện pháp thì hiệu quả sẽ không cao. Vì vậy ngƣời ta thƣờng kết hợp nhiều biện pháp với nhau để giảm đến mức tối thiểu thiệt hại do virus gây ra. Biện pháp quản lý hiệu quả nhất là phòng ngừa, bao gồm các kỹ thuật:

Bảo vệ cây con: cây con rất dễ bị nhiễm TSWV vì vậy cây con cần đƣợc trồng ở những nơi có cây trồng nhạy cảm với TSWV, trồng trong nhà kính hoặc sử

dụng màng che cẩn thận. Phun thuốc diệt côn trùng đều đặn để làm giảm khả năng sống của bọ trĩ trong vƣờn ƣơm.

Cần phải loại ra và tiêu hủy nhanh chóng những cây có biểu hiện bệnh và những cây nghi ngờ nhiễm bệnh tiềm ẩn.

Tránh trồng độc canh, nên hạn chế trồng cùng một loại cây trồng nhiều lần trên một ruộng đất.

Trồng luân canh giữa các loại cây trồng nhạy cảm và không nhạy cảm với TSWV để loại bỏ mầm bệnh.

Trồng với mật độ thích hợp sẽ hạn chế đƣợc bệnh. Sử dụng cây trồng sạch bệnh, cây kháng bệnh.

Loại bỏ những nguồn chứa TSWV, cày đất nơi thu hoạch, loại bỏ các loài cỏ dại là ký chủ của TSWV chung quanh đồng ruộng.

Nên bỏ hoang các đồng ruộng bị nhiễm bệnh khoảng 1 tháng.

Sử dụng nhiều loại thuốc trừ sâu khác nhau, đúng liều lƣợng và thời gian hợp lý để tiêu diệt đƣợc nhiều loài bọ trĩ cùng một lúc và đạt đƣợc kết quả tốt nhất.

Khống chế bọ trĩ bằng biện pháp sinh học là có hiệu quả và có lợi nhất lại không ảnh hƣởng đến môi trƣờng.

2.3. Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh

2.3.1. Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng (Vũ Triệu Mân, 2003)

Triệu chứng là những biểu hiện bên ngoài, phản ánh đặc điểm riêng biệt của một loại bệnh do một nguyên nhân nào đó gây ra. Đối với bệnh này, chẩn đoán theo triệu chứng bệnh là một phƣơng pháp nhanh chóng, khá chính xác. Vì vậy, có thể căn cứ vào triệu chứng bên ngoài điển hình về hình thái vết bệnh, màu sắc vết bệnh, vị trí và bộ phận cây bị bệnh mà chẩn đoán bệnh.

Tuy nhiên trong một số trƣờng hợp cũng dẫn đến nhầm lẫn, nhất là trong trƣờng hợp chẩn đoán các bệnh có triệu chứng bên ngoài tƣơng tự nhau nhƣng do các tác nhân khác nhau gây ra. Triệu chứng bên ngoài vẫn có thể biến đổi ít nhiều

tùy thuộc vào đặc điểm của giống cây, kỹ thuật canh tác và yếu tố ngoại cảnh. Do đó, trong những trƣờng hợp phức tạp cần phải tiến hành chẩn đoán bệnh bằng các phƣơng pháp bổ sung khác.

2.3.2. Phƣơng pháp chẩn đoán bằng cây chỉ thị (Vũ Triệu Mân, 2003)

Cây chỉ thị là những cây ký chủ nhƣng có triệu chứng bệnh rất điển hình và biểu hiện bệnh nhanh chóng. Phƣơng pháp chẩn đoán bằng cây chỉ thị là một phƣơng pháp khá chính xác trong nghiên cứu bệnh virus thực vật. Đối với virus cây chỉ thị đƣợc chia làm hai nhóm:

Nhóm cây nhiễm bộ phận: là những cây chỉ thị mà khi truyền bệnh nhân tạo sẽ có vết chết cục bộ ngay trên bề mặt lá mà không di chuyển đến những bộ phận khác của cây.

Nhóm cây nhiễm hệ thống: là những cây chỉ thị mà khi truyền bệnh nhân tạo sẽ tạo sự chết hệ thống trên toàn cây.

2.3.3. Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử (Vũ Triệu Mân, 2003) 2003)

Trong tế bào ký chủ, virus thƣờng ở dạng kết tinh vô định hình hoặc có hình dạng đặc trƣng bởi vô số cá thể virus kết hợp với nhau. Các tinh thể này đôi khi rất khó quan sát thấy. Vì vậy, để tìm hiểu hình thái và cấu trúc của virus thực vật cũng nhƣ mô thực vật bị nhiễm bệnh, ngƣời ta sử dụng kính hiển vi điện tử với độ phóng đại lớn.

Phƣơng pháp trực tiếp và đơn giản nhất là sử dụng dung dịch chứa virus chiết từ lá cây bệnh hay đã đƣợc làm tinh khiết cố định bằng hóa chất trên lƣới đồng để quan sát dƣới kính hiển vi điện tử.

Có thể sử dụng kháng huyết thanh khi dùng phƣơng pháp xem trực tiếp để phân biệt trong trƣờng hợp nghi ngờ mẫu có lẫn virus khác.

Ngoài ra ngƣời ta còn dùng lát cắt mỏng bằng máy cắt tiêu bản hiển vi và nhuộm mẫu đƣợc cắt, sau đó quan sát sự hiện diện của virus trong các tế bào thực vật bị nhiễm bệnh đƣợc cắt.

2.3.4. Phƣơng pháp ELISA (Vũ Triệu Mân, 2003)

Phƣơng pháp ELISA có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung đều dựa trên cơ sở sự bắt cặp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể đƣợc gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thƣờng là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cƣờng độ màu mà biết đƣợc nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện.

Phƣơng pháp ELISA cho phép phát hiện và định lƣợng các thành phần nhƣ là: peptide, kháng nguyên, kháng thể, enzyme, hormone…1978 Clark và Adam đã thành công trong việc ứng dụng kỹ thuật ELISA để chuẩn đoán bệnh virus hại khoai tây và từ đó kỹ thuật này đƣợc công nhận là có độ chính xác cao hơn các phƣơng pháp huyết thanh học thông thƣờng.

Kỹ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml). So với kĩ thuật miễn dịch phóng xạ RIA (Radio Immuno Assay) thì kỹ thuật này rẻ tiền và an toàn hơn nhƣng vẫn đảm bảo độ chính xác nhƣ nhau.

Thành phần cơ bản của phản ứng ELISA gồm: kháng nguyên, kháng thể, và cơ chất tạo màu. Có 3 phƣơng pháp chính làm nền tảng cho tất cả các dạng ELISA là:

ELISA trực tiếp (Direct ELISA): Đây là dạng đơn giản nhất của phƣơng pháp ELISA. Trong đó, kháng nguyên cần phát hiện sẽ đƣợc gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể và sẽ đƣợc phát hiện bằng một kháng thể duy nhất (kháng thể này đã đƣợc gắn enzyme).

ELISA gián tiếp (Indirect ELISA): Phƣơng pháp này khác ELISA trực tiếp ở chỗ kháng thể bắt kháng nguyên không đƣợc gắn enzyme mà nó là mục tiêu gắn đặc hiệu của một kháng thể khác (kháng thể này mới là kháng thể đƣợc gắn với enzyme).

Sandwich ELISA: Đây là một dạng ELISA đƣợc sử dụng phổ biến nhất trong thực tiễn do nó cho phản ứng mạnh và nhạy. Kết quả thí nghiệm đƣợc đánh giá thông qua sự kết hợp của hai loại kháng thể là kháng thể bắt (kháng thể sơ cấp) và kháng thể phát hiện (kháng thể thứ cấp).

Kĩ thuật này cũng đƣợc phân làm hai dạng: Direct sandwich ELISA Indirect sandwich ELISA

2.3.5. Phƣơng pháp RT – PCR

2.3.5.1. Nguyên tắc của phƣơng pháp PCR (Bùi Chí Bửu, 1999)

Khi DNA polymerase hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt.

Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Do đó nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi. Điều đó có nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA xác định ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đủ để thiết kế các mồi bổ sung chuyên biệt. Các mồi này bao gồm một mồi xuôi (sens primer hay forward primer) và một mồi ngƣợc (antisens primer hay reverse primer).

PCR đƣợc thực hiện trên cơ sở phản ứng sinh tổng hợp DNA theo 3 bƣớc sau:

Biến tính phân tử DNA (Denature)

Sự bắt cặp giữa mồi và mạch khuôn (Annealing) Tổng hợp mạch mới (Extension)

Ba bƣớc này hợp thành một chu kì và đƣợc lặp lại nhiều lần.

Những phản ứng này đƣợc thực hiện nhờ một enzyme polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase) và sự thay đổi chu kì nhiệt hợp lý, đặc biệt là nhiệt độ cho quá trình biến tính và bắt cặp.

2.3.5.2. Nested PCR (Mc Pherson M.J., 2000)

Đây là dạng cải biến của phƣơng pháp PCR, trong đó phản ứng sẽ đƣợc thực hiện lần lƣợt với hai hay nhiều cặp mồi, sau đó các mồi còn lại sẽ khuếch đại những đoạn nằm bên trong của sản phẩm PCR ban đầu bằng cách sử dụng sản phảm PCR đầu tiên này làm khuôn mẫu.

Phƣơng pháp nested – PCR cũng có thể thực hiện với một cặp mồi đầu tiên và một mồi đơn cho phản ứng nested – PCR sau đó. Phƣơng pháp này đƣợc gọi là Heminested – PCR (HN – PCR).

Với phƣơng pháp này, độ đặc hiệu của phản ứng tăng lên nhiều do mồi “nested” sẽ loại bỏ hầu nhƣ tất cả các sản phẩm không đặc hiệu của lần PCR đầu tiên. Tuy nhiên sử dụng nhiều mồi nên độ nhạy của phản ứng cũng tăng lên, do đó phản ứng dễ nhiễm hơn so với PCR thông thƣờng. Vì vậy phải hết sức cẩn thận khi thao tác ở từng giai đoạn PCR .

2.3.5.3. RT – PCR (Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction)

Cùng với các phƣơng pháp: Real Time PCR, Nested PCR thì RT – PCR là một cải biến của phƣơng pháp PCR thông thƣờng nhằm đáp ứng những mục đích sử dụng khác nhau.

Do Taq polymerase không hoạt động trên RNA nên ngƣời ta sử dụng kỹ thuật RT – PCR. Trƣớc hết RNA đƣợc chuyển thành cDNA nhờ enzyme phiên mã ngƣợc . Mồi sử dụng trong giai đoạn này có thể là mồi “ngƣợc” của PCR giai đoạn sau, có thể là oligonucleotide T (để bắt cặp với đuôi poly A của mRNA), mà cũng có thể là hexanucleotide (trình tự gồm 6 nucleotide) bắt cặp ngẫu nhiên với một trình tự ngắn trên RNA. Sau đó cDNA đƣợc khuếch đại nhờ Taq polymerase. Ngƣời ta cũng có thể sử dụng Tth polymerase cho cả hai giai đoạn. Kỹ thuật RT – PCR cho phép nghiên cứu các mRNA tồn tại với hàm lƣợng rất thấp, không thể phát hiện bằng các phƣơng pháp cổ điển nhƣ Northern blot (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998).

RT – PCR một bƣớc: trong kỹ thuật RT – PCR một bƣớc quá trình tổng hợp cDNA và quá trình khuếch đại diễn ra trong cùng một phản ứng.

Hình 2.4. Quy trình RT – PCR một bƣớc

RT – PCR hai bƣớc: trong kỹ thuật này quá trình tổng hợp cDNA và quá trình khuếch đại diễn ra ở phản ứng tách biệt nhau.

 Tổng hợp cDNA trên khuôn RNA gồm ba bƣớc : Ly trích RNA tổng số, trong đó có RNA của virus.

Tổng hợp cDNA reverse transcriptase. Tùy thuộc vào mục đích thí nghiệm, primer để tổng hợp sợi DNA đầu tiên có thể đƣợc lai chuyên biệt với một gen đích hay có thể kết hợp với toàn RNA. Có ba loại primer có thể dùng trong tổng hợp cDNA.

(1) Oligo (dT): kết hợp với đuôi poly A của mRNA của động vật hữu nhũ. (2) Primer chuyên biệt với trình tự đã chọn trên RNA đích.

(3) Random hexanucleotide: có thể khởi đầu sự tổng hợp cDNA ở nhiều điểm trên RNA khuôn mẫu tạo ra nhiều đoạn bản sao của toàn phân tử RNA. Chúng hữu dụng khi RNA đích là quá dài hay chứa quá nhiều cấu trúc bậc hai đến nỗi sự tổng hợp cDNA không bắt đầu hiệu quả bởi oligo (dT) hay primer chuyên biệt. Trong hầu hết trƣờng hợp, mục đích của những nhà nghiên cứu là tạo cDNA ban đầu dài và chứa nhiều thành phần của phân tử bổ sung với trình tự RNA đích. Do đó primer chuyên biệt là lựa chọn tốt nhất. Tiếp đến là oligo (dT) cũng tốt cho sự lựa chọn. Random hexamer không chuyên biệt và tạo ra những phân tử cDNA dài, ngắn khác nhau đƣợc sử dụng khi những phƣơng pháp kia không hiệu quả.

 Khuếch đại cDNA lên nhiều bản bằng PCR. Giai đoạn này gồm có 3 bƣớc nhƣ sau:

Biến tính: chuyển dây đôi thành dây đơn

Bắt cặp: primer gắn vào vị trí chuyên biệt có trình tự bổ xung với nó trên cDNA khuôn mẫu.

Kéo dài: kéo dài chuỗi mới nhờ enzyme polymerase.

Ba giai đoạn này lặp lại nhiều lần, để tạo nhiều sản phẩm khuếch đại. Ba giai đoạn này xảy ra trong điều kiện nhiệt độ khác nhau (thông thƣờng: 94o

C, 55^oC, 72^oC) với sự trợ giúp của enzyme polymerase. Sự lặp lại theo chu kỳ thƣờng xảy ra khoảng 30 lần để làm tăng các DNA muốn có khoảng 100 triệu lần.

Một kỹ thuật mới phát triển là kỹ thuật in situ RT – PCR cho phép khuếch đại các RNA ngay trên mô và tế bào. Kỹ thuật này có nguyên tắc nhƣ trên, đƣợc

tiến hành trên lát cắt mô, tế bào cố định trên lame, trong thiết bị PCR có bộ phận tạo nhiệt chuyên cho lame.

2.4. Một số kết quả nghiên cứu về TSWV

Sonya Broughton, Roger Jones và Brenda Coutts (2004) nghiên cứu về biện pháp quản lý bọ trĩ và bệnh TSWV.

John M. Sherman, James W. Moyer, và Margaret E. Daub (1998) khảo sát khả năng chống chịu của cây hoa cúc với sự biểu hiện gene N (Nucleocapsid) của virus TSWV.

M. T. Momol, J. E. Funderburk, S. Olson và J. Stavisky (2002) đánh giá hiệu quả của việc sử dụng lớp phủ phản chiếu tia UV và sử dụng Acibenzolar – S – methyl nhằm quản lý TSWV.

M. D. Bandla, L. R. Campbell, D. E. Ullman, và J. L. Sherwood (1997) sử dụng kỹ thuật điện di protein và phản ứng huyết thanh có đánh dấu huỳnh quang để nghiên cứu về sự tƣơng tác giữa Glycoprotein của TSWV với thụ thể tiếp nhận ở thành dạ dày bọ trĩ.

2.4.2. Nghiên cứu trong nƣớc

Nghiên cứu về virus nói chung và TSWV nói riêng còn khá mới, chủ yếu là