Progesterone do hồng thể từ buồng trứng tiết ra. Các tế bào trong nang sau khi rụng trứng vẫn cịn dính trong buồng trứng và giữ vai trị rất quan trọng trong quá trình sinh sản, chúng phát triển to ra, và tăng tiết progesterone.
Hồng thể tổng hợp progesterone từ cholesterol, khi qua gan sẽ bị thối hĩa và biến thành pregnandiol và thải qua nƣớc tiểu.
Ngồi hồng thể thì vỏ thƣợng thận cũng sản xuất một ít progesterone và nhau thai tiết ra ở 5 tháng cuối thời kỳ mang thai (Nguyễn Minh Thanh, 2005).
2.6.2 Bản chất, khối lƣợng phân tử, cấu trúc phân tử
Progesterone là một hormone steroid với 21 carbone. Progesterone cịn tổng hợp và phân tiết từ nhau thai trong suốt giai đoạn thú cái cĩ mang.
Tác dụng sinh học với cƣờng độ mạnh giúp cho thú cái hồn thành bản năng làm mẹ.
Progesterone cĩ cơng thức phân tử là C12H30O2. Khối lƣợng phân tử là 314,45.
Progesterone đƣợc phân tách từ hồng thể heo nái cĩ cấu trúc phân tử gồm: hai dạng tinh thể là dạng bền vững và khơng bền vững.
Progesterone ở dƣới dạng những tinh thể khơng màu hay bội kết tinh màu trắng khơng mùi.
Nĩng chảy ở 1270C – 1290C.
Thực tế khơng tan trong nƣớc, tan trong cồn, tan trong ete, dễ tan trong chloroform, ít tan trong dầu.
Phản ứng màu Zimmernam cho màu đỏ.
Phản ứng tạo bis dinitrophenylhyrazon-progesterone.
Đun nĩng progesterone và dinitro-2,4-phenylhydrazin trong cồn với sự cĩ mặt của HCl thì cĩ sự xuất hiện kết tủa đỏ nâu của bis dinitrophenylhyrazon- progesterone, chất nĩng chảy ở 2700C – 2800C (Nguyễn Minh Thanh, 2005).
2.6.3 Vận chuyển và chuyển hĩa progesterone và tác dụng của progesterone
Vận chuyển và chuyển hĩa: Khi đƣợc vận chuyển trong máu dƣới dạng gắn chủ yếu với albumin huyết tƣơng và các globulin gắn đặc hiệu với progesterone, vài phút sau khi đƣợc bài tiết tất cả progesterone đƣợc thối hĩa thành các steroid khác khơng cịn tác dụng của progesterone. Gan rất quan trọng trong quá trình chuyển hĩa này. Progesterone cĩ sản phẩm cuối cùng là pregnandiol đƣợc bài xuất theo nƣớc tiểu; vì vậy, cĩ thể đánh giá mức độ tạo thành progesterone trong cơ thể thơng qua mức bài xuất progesterone qua đƣờng tiểu.
Sự tác dụng của progesterone lên tử cung: Kích thích sự bài tiết của niêm mạc tử cung ở trạng thái sẵn sàng đĩn trứng đã thụ tinh và làm tổ. Kích thích tế bào tuyến niêm mạc tử cung bài tiết một lớp dịch quánh dày và tác dụng lên vịi Fallope, progesterone kích thích tế bào niêm mạc, vịi Fallope bài tiết dịch chứa chất dinh dƣỡng để nuơi dƣỡng trứng đã thụ tinh, thực hiện quá trình phân chia trong khi di chuyển vào buồng tử cung.
Tác dụng lên tuyến vú: Làm phát triển tuyến thùy kích thích tế bào tuyến vú tăng sinh và trở nên cĩ khả năng bài tiết.
Tác dụng lên cân bằng điện giải: Steroid khác progesterone với nồng độ cao cĩ thể tăng sự tái hấp thu với Na+, Cl- và nƣớc ở ống lƣợn xa.
Thực tế cho thấy, progesterone thƣờng gây bài xuất ion Na+ và nƣớc; vì, progesterone cĩ khả năng cạnh tranh với aldosterone để gắn vào thụ thể sẽ làm tăng tái hấp thu ion và nƣớc, tác dụng này của progesterone lại yếu hơn nhiều so với aldosterone; cho nên, cơ thể mất nƣớc và muối thì khơng đƣợc tái hấp thu, sự tăng ion Na+ đƣợc bài xuất nên lại đƣợc tăng tiết aldosterone từ tuyến vỏ thƣợng thận, hiện tƣợng này thƣờng gặp ở thời kỳ cĩ thai.
Ảnh hƣởng thân nhiệt: Nhiệt độ của cơ thể tăng từ 0,3 – 0,50C do sự tác động của progesterone, nhƣng cơ chế làm tăng nhiệt độ của progesterone thì chƣa rõ. Cĩ ý kiến cho rằng progesterone tác dụng lên trung tâm điều nhiệt ở vùng dƣới đồi.
Điều hịa bài tiết: Progesterone chịu ảnh hƣởng điều khiển trực tiếp của hormone LH, do tuyến yên bài tiết. Nếu nồng độ LH tăng trong máu, hồng thể sẽ
đƣợc nuơi dƣỡng và bài tiết nhiều progesterone. Ngƣợc lại, nếu mà tuyến yên bài tiết ít LH, hồng thể sẽ bị thối hĩa và progesterone sẽ đƣợc bài tiết ít.
Tĩm lại, progesterone cĩ tác dụng đặc biệt quan trọng nĩ làm cho quá trình cĩ thai xảy ra bình thƣờng và cĩ các tác dụng nhƣ sau:
Phát triển tế bào nội mạc tử cung, những tế bào này đĩng vai trị quan trọng trong việc nuơi dƣỡng bào thai ở thời kỳ đầu.
Progesterone giảm co bĩp tử cung khi cĩ thai, do đĩ ngăn cản sẩy thai.
Progesterone làm tăng bài tiết dịch và niêm mạc tử cung để cung cấp dinh dƣỡng cho phơi.
Progesterone ảnh hƣởng đến quá trình phân chia của trứng đã thụ tinh. Progesterone cĩ tác dụng làm phát triển thùy và bọc tuyến vú.
Với những tác động trên, gọi progesterone là hormone an thai… Vì lý do nào đĩ nồng độ progesterone giảm đi, và sự phát triển bào thai sẽ bị ảnh hƣởng.
Cơ quan sinh dục chuẩn bị là tổ hợp tử nuơi dƣỡng bào thai, progesterone làm cho tử cung yên tĩnh; đồng thời, giúp cho lớp niêm mạc tử cung phát triển và làm cho các tuyến ống thẳng phân nhánh, xoắn lại để chuẩn bị tiết sữa sau này.
Khi hàm lƣợng progesterone tăng cao trong máu ngoại biên chúng tỏ cĩ sự hiện diện của hồng thể trong buồng trứng.
Hiện nay, kiểm sốt sinh sản ở thú cái progesterone là chỉ tiêu cần kiểm tra, chủ yếu là tính ổn định về nồng độ phản ánh ở giai đoạn của chu kỳ động dục và sự ổn định của bào thai (Nguyễn Minh Thanh, 2005).
2.6.4 Động thái progesterone trong chu kỳ động dục bình thƣờng, mang thai 2.6.4.1 Động thái progesterone trong chu kỳ động dục bình thƣờng 2.6.4.1 Động thái progesterone trong chu kỳ động dục bình thƣờng
Hàm lƣợng progesterone thấp nhất vào ngày động dục với mức nhỏ hơn 1 ng/ml. Sau đĩ tăng dần lên từ ngày thứ 3 của chu kỳ. Hàm lƣợng progesterone đạt đỉnh cao từ ngày 9 đến ngày 18 của chu kỳ động dục với mức lớn hơn 3 ng/ml. Đỉnh cao của hàm lƣợng progesterone khơng cố định vào một ngày nào trong khoảng thời gian từ ngày thứ 9 đến ngày thứ 18 của chu kỳ động dục. Từ ngày thứ
19 của chu kỳ thì hàm lƣợng progesterone giảm xuống rất nhanh và đạt mức thấp nhất vào ngày thứ 20 đến ngày thứ 21 của chu kỳ với mức nhỏ hơn 1 ng/ml.
Từ việc xác lập động thái progesterone trong chu kỳ động dục bình thƣờng đã cho chúng ta rất nhiều ứng dụng trong thực tiễn, đặc biệt là việc xác lập động thái progesterone trong các trƣờng hợp khác nhau của rối loạn sinh sản do nội tiết, từ đĩ biết đƣợc tình trạng hoạt động của buồng trứng.
Hình 2.3 Động thái progesterone trong chu kỳ động dục bình thƣờng ở bị
(Chung Anh Dũng, 2002)
2.6.4.2 Động thái progesterone lúc mang thai
Số liệu thống kê cho thấy cĩ khoảng 27,4% số bị cái khơng thụ thai sau khi gieo tinh nhân tạo, nhƣng vẫn khơng phát hiện đƣợc triệu chứng động dục trở lại cho đến ngày 60 khám thai qua trực tràng sau khi gieo tinh nhân tạo. Nhƣ vậy, nếu chỉ với biện pháp khám thai qua trực tràng nhƣ hiện nay thì số bị này đã cĩ khoảng cách tăng đáng kể giữa 2 lứa đẻ, ít nhất là tăng 2 tháng. Trong khi đĩ, các nghiên cứu cũng chứng minh rằng việc khám thai qua trực tràng tốt nhất cũng nên thực hiện sớm nhất vào ngày thứ 60 sau khi gieo tinh nhân tạo. Nếu thực hiện kỹ thuật này sớm hơn, trong giai đoạn 40 ngày sau khi gieo tinh nhân tạo sẽ làm tăng đáng
GIAI ĐỌAN NGHỈ NGƠI
(Anestrus phase)
GIAI ĐỌAN TIỀN ĐỘNG DỤC (Proestrus phase) GIAI ĐOẠN ĐỘNG DỤC (Estrus phase) GIAI ĐOẠN SAU ĐỘNG DỤC (Post estrus phase) Pr og es te ro n tr on g ma ùu (n g/m l)
Ngày trong chu kỳ động dục
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
GIAI ĐỌAN NGHỈ NGƠI
(Anestrus phase)
GIAI ĐỌAN TIỀN ĐỘNG DỤC (Proestrus phase) GIAI ĐOẠN ĐỘNG DỤC (Estrus phase) GIAI ĐOẠN SAU ĐỘNG DỤC (Post estrus phase) Pr og es te ro n tr on g ma ùu (n g/m l)
Ngày trong chu kỳ động dục
kể tỷ lệ sẩy thai từ 10% đến 11%. Đo hàm lƣợng progesterone trong máu hoặc sữa vào ngày thứ 21 đến ngày thứ 24 sau khi gieo tinh để cĩ thể xác định tình trạng cĩ hay khơng cĩ thai ở bị cái. Cơ sở của việc ứng dụng hàm lƣợng progesterone vào ngày thứ 21 sau khi gieo tinh để xác định sớm sự mang thai của bị cái.
Hình 2.4 Động thái progesterone giúp chẩn đốn sớm cĩ thai
(Chung Anh Dũng, 2002)
2.6.5 Các chỉ định và ứng dụng của xét nghiệm progesterone trong sữa 2.6.5.1 Chẩn đốn bị mang thai và khơng mang thai 2.6.5.1 Chẩn đốn bị mang thai và khơng mang thai
Việc chẩn đốn cĩ thai sớm bằng progesterone chính xác khoảng 80%, 20% sai sĩt là do sự khác nhau về độ dài của chu kỳ động dục giữa các bị, các nhầm lẫn trong phát hiện động dục, bệnh tử cung nhƣ bọc mủ tử cung, hoạt động khác thƣờng của buồng trứng nhƣ u nang thể vàng hoặc nang trứng và phơi chết sớm. Việc sử dụng progesterone để chẩn đốn cĩ thai cần phải kết hợp với khám thai 40 ngày, hoặc muộn hơn sau khi phối giống. Tuy nhiên, với một loạt các mẫu lấy vào ngày 0 (ngày phối tinh) và các ngày thứ 21 và 24, việc chẩn đốn sự khơng cĩ thai cĩ thể
Chẩn đóan có thai dựa vào hàm lượng progestron … … … … Không có thai Pr o g e st e ro n tr o n g ma ùu (n g /m l)
Ngày trong chu kỳ động dục
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Có thai Chẩn đóan có thai dựa vào hàm lượng progestron … … … … Không có thai Pr o g e st e ro n tr o n g ma ùu (n g /m l)
Ngày trong chu kỳ động dục
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Có thai
đạt tới độ chính xác 95 – 100%. Do vậy, progesterone vốn đƣợc coi là cơng cụ để chẩn đốn cĩ thai sớm nên đƣợc sử dụng cho mục đích chẩn đốn khơng cĩ thai và từ đĩ cĩ thể xác định đƣợc tình trạng cĩ thai hay khơng cĩ thai của gia súc. Việc sớm xác định khơng cĩ thai này sẽ tránh đƣợc sự bỏ lỡ cơ hội phối giống tiếp theo (Chung Anh Dũng, 2002).
2.6.5.2 Xác nhận động dục
Bị cái thƣờng khơng cĩ dấu hiệu động dục rõ ràng dẫn đến việc quyết định phối giống sai. Vào thời điểm phối tinh cĩ tới 15 – 20% bị sữa khơng động dục. Ở một số trang trại, tỷ lệ phát hiện động dục sai cĩ thể cao tới 50% hoặc hơn. Progesterone trong sữa cĩ thể dùng để xác định động dục ở bị. Nếu mẫu sữa kiểm tra cho thấy hàm lƣợng progesterone cao thì cĩ thể bị khơng động dục và cần đƣợc theo dõi cẩn thận cũng nhƣ kiểm tra lại các mẫu lấy vào thời điểm muộn hơn. Cĩ thể tiến hành đơn giản bằng cách giữ lại mẫu sữa vào thời điểm bị đƣợc đƣa ra để phối tinh cho đến khoảng 2 tuần hoặc một tháng sau. Nếu nhiều hơn 10% số bị đƣợc phối tinh vào thời điểm cĩ hàm lƣợng progesterone cao thì cĩ thể chứng minh đƣợc là việc phát hiện động dục khơng chính xác.
Các stress với mơi trƣờng cĩ tác động rất lớn đến hiệu quả sinh sản. Đặc biệt, stress nhiệt là nguyên nhân dẫn đến việc giảm nghiêm trọng tỷ lệ cĩ thai, tăng tỷ lệ chết phơi sớm, giảm độ dài và cƣờng độ của các biểu hiện động dục và làm giảm thể trọng bé sinh ra. Ngày nay ngƣời ta đã sử dụng progesterone trong sữa để trợ giúp cho các chƣơng trình phối giống trong điều kiện gia súc bị stress do mơi trƣờng (Chung Anh Dũng, 2002).
2.7 Nguyên lý kỹ thuật ELISA (Progesterone – Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) Sorbent Assay)
Phản ứng ELISA thƣờng kết hợp kháng nguyên – kháng thể khơng thể phát hiện bằng mắt thƣờng, kỹ thuật ELISA đã lợi dụng đặc tính hấp thụ tự nhiên của protein lên polyethylen đã gắn kháng nguyên hoặc kháng thể lên giá rồi cho kháng nguyên hoặc kháng thể tƣơng ứng cĩ đánh dấu enzyme và tạo phản ứng.
Bỏ chất đánh dấu khơng kết hợp, cho thêm vào hỗn hợp chất hiện màu. Cũng nhờ hoạt tính xúc tác của enzyme giải phĩng oxy nguyên tử [O] từ H2O từ oxy hĩa hiện màu làm thay đổi màu của hỗn dịch. Nhƣ vậy, kỹ thuật ELISA gồm cĩ 3 thành phần tham gia phản ứng (kháng nguyên, kháng thể và chất hiện diện màu) đồng thời thực hiện cĩ 2 bƣớc:
Trong phản ứng miễn dịch: là sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể.
Trong phản ứng hĩa học:nhờ hoạt tính của enzyme để giải phĩng [O] vì chính [O] này oxi hố chất chỉ thị màu. Chất chỉ thị thay đổi màu cĩ nghĩa là chứng minh sự cĩ mặt của enzyme và chứng minh sự kết hợp giữa kháng nguyên với kháng thể. Cĩ 2 loại kỹ thuật ELISA chính: kỹ thuật ELISA trực tiếp và kỹ thật ELISA gián tiếp.
– Kỹ thuật ELISA trực tiếp: khi kháng nguyên đƣợc gắn vào đáy giếng phản ứng sau đĩ phủ lên kháng thể đặc hiệu gắn enzyme, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp. Khi rửa để loại bỏ kháng thể gắn enzyme khơng kết hợp với kháng nguyên và cho vào giếng chất hiện màu. Đọc kết quả bằng phổ kế sau 10 phút.
Kết quả cĩ 2 trƣờng hợp xảy ra:
Kháng nguyên đặc hiệu với kháng thể thì sẽ cĩ sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể gắn enzyme khơng bị rửa trơi. Enzyme sẽ giải phĩng [O] từ H2O2 để oxy hĩa chất hiện màu, kết quả làm thay đổi màu hỗn dịch trong giếng.
Kháng nguyên khơng đặc hiệu với kháng thể thì khơng xảy ra sự kết hợp kháng nguyên với kháng thể, enzyme bị rửa trơi, kết quả là hỗn dịch trong giếng phản ứng khơng thay đổi màu.
– Kỹ thật ELISA gián tiếp: Theo nguyên tắc kỹ thuật ELISA trực tiếp và gián tiếp khơng khác nhau, nhƣng kỹ thuật gián tiếp cĩ thêm một bƣớc phản ứng.
Conjugate trong kỹ thuật trực tiếp là kháng thể đặc hiệu gắn với enzyme, trong khi đĩ, conjugate của phản ứng gián tiếp là kháng thể khác với enzyme và đọc kết quả xảy ra 2 trƣờng hợp:
Nếu nhƣ kháng nguyên đặc hiệu với kháng thể, sẽ cĩ sự kết hợp kháng nguyên – kháng thể và sự kết hợp giữa conjugate với phức hợp kháng nguyên kháng thể, trong giếng hỗn dịch cĩ enzyme để giải phĩng [O] từ H2O2, oxy hố chất hiện màu làm thay đổi màu hỗn dịch (phản ứng dƣơng tính).
Khi kháng nguyên khơng đặc hiệu với kháng thể thì khơng cĩ sự kết hợp kháng nguyên – kháng thể bị rửa trơi, đồng thời, conjugate khơng kết hợp với kháng nguyên cũng bị rửa trơi, hỗn dịch khơng cĩ sự kết hợp với kháng nguyên với kháng thể, kháng thể bị rửa trơi và conjugate khơng kết hợp với kháng nguyên cũng bị rửa trơi, hỗn dịch sẽ khơng cĩ enzyme để giải phĩng enzyme [O] từ H2O2, chất hiện màu khơng bị oxy hố, hỗn dịch khơng thay đổi màu (phản ứng âm tính). (Ngơ Phƣơng Nghị, 2003)
Chƣơng 3
NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 3.1.1 Thời gian 3.1.1 Thời gian
Từ tháng 03/2007 đến tháng 07/2007.
3.1.2 Địa điểm
Đề tài thực hiện tại các hộ chăn nuơi bị sữa và Cơng ty Cổ Phần Bị Sữa huyện Long Thành, tỉnh Đồng Nai. Mẫu sữa xét nghiệm đƣợc phân tích tại Trung Tâm Phân Tích Trƣờng Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
3.2 Đối tƣợng khảo sát
– 20 con bị sữa Holstein Friesian (HF) nhĩm máu 50 và 75% HF thuộc các lứa 1, 2, 3 và 4 sinh sản bình thƣờng.
– 20 con bị sữa Holstein Friesian (HF) nhĩm máu 50 và 75% HF sau khi sinh từ 90 ngày trở lên thuộc các lứa 1, 2, 3 và 4 khơng động dục hoặc phối giống nhiều lần khơng đậu.
3.3 Nội dung khảo sát
Lấy mẫu sữa của bị đƣợc phân theo nhĩm máu, lứa đẻ ở các ngày thứ nhất