cazein
3.8.1. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm
và BM trên môi trường có chất cảm ứng là cazein
Chúng tôi tiến hành nuôi các chủng nghiên cứu trong môi trường cơ sở với chất cảm ứng là cazein ở các nồng độ khác nhau, nuôi lắc ở nhiệt độ
phòng với vận tốc là 125 vòng/phút. Đánh giá sự phát triển của các chủng bằng cách tiến hành đo mật độ quang OD620nm ở các thời điểm khác nhau.
Bảng 3.6. Sự sinh trưởng của chủng Bs trên môi trường có cazein
Môi trường Nồng độ cazein (%) OD620nm sau 24h nuôi cấy OD620nm sau 30h nuôi cấy OD620nm sau 36h nuôi cấy OD620nm sau 42h nuôi cấy Đối chứng (môi trường NA) 0 0,3 0,54 0,53 0,34 2 0,8 0,90 0,86 0,80 3 1,09 1,25 1,21 1,15
Môi trường cơ sở
+ cazein
4 0,98 1,12 1,08 1,00
Bảng 3.7. Sự sinh trưởng của chủng Bm trên môi trường có cazein
Môi trường Nồng độ cazein (%) OD620nm sau 24h nuôi cấy OD620nm sau 30h nuôi cấy OD620nm sau 36h nuôi cấy OD620nm sau 42h nuôi cấy Đối chứng (môi trường NA) 0 0,7 0,85 0,86 0,85 2 0,66 0,80 0,70 0,62 3 0,70 1,00 0,72 0,65
Môi trường cơ
sở + cazein
4 0,83 0,85 0,85 0,80
Bảng 3.8. Sự sinh trưởng của chủng BM trên môi trường có cazein
Môi trường Nồng độ cazein (%) OD620nm sau 24h nuôi cấy OD620nm sau 30h nuôi cấy OD620nm sau 36h nuôi cấy OD620nm sau 42h nuôi cấy Đối chứng (môi trường NA) 0 0,35 0,90 0,84 0,78 2 0,61 0,67 0,67 0,63 3 0,80 0,87 0,83 0,80
Môi trường cơ
sở + cazein
Qua ba bảng 3.6, 3.7, 3.8 chúng tôi nhận thấy, ở nồng độ cazein là 3% thì thích hợp cho sự sinh trưởng của cả 3 chủng Bs, Bm và BM. Sự sinh trưởng đạt tối đa trong khoảng 30 đến 36 giờ.
3.8.2. Nghiên cứu quá trình sinh enzyme proteaza của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là cazein
Chúng tôi tiến hành nuôi chủng trong môi trường cơ sở với chất cảm ứng là cazein ở các nồng độ khác nhau, lắc với vận tốc 125 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó tiến hành thử hoạt tính proteaza ở các thời điểm khác nhau bằng phương pháp đục lỗ thạch.
Hình 11: Hoạt tính enzyme proteaza của chủng Bs trên môi trường có chất cảm ứng là cazein
Hình 12: Hoạt tính enzyme proteaza của chủng Bm trên môi trường có chất cảm ứng là cazein
Hình 13: Hoạt tính enzyme proteaza của chủng BM trên môi trường có chất cảm ứng là cazein
Qua ba hình 11, 12, 13 chúng tôi nhận thấy trong môi trường có nồng độ cazein là 3% (30g cazein/ 1lít môi trường) thì quá trình sinh enzyme ngoại bào proteaza của cả 3 chủng Bs, Bm và BM là tối đa. Điều này chứng tỏ cazein là chất cảm ứng với proteaza rõ rệt.
Quan hệ giữa sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme proteaza ngoại bào cũng tương tự như ở trường hợp sinh amylaza: sinh trưởng đạt mức tối đa ở 30 giờ, còn enzyme ở mức 36 giờ nuôi cấy.
3.9. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng và sinh enzyme của các chủng
Bs, Bm, BM trên môi trường có bổ sung CaCO3
Trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn Bacillus pH môi trường thường giảm làm cho môi trường axit và như vậy sẽ ảnh hưởng đến sinh trưởng của vi khuẩn. Muốn vi khuẩn phát triển tốt ta cần giữ pH môi trường lớn hơn 6,5. Muốn vậy, trong môi trường có bổ sung CaCO3 thì CaCO3 ở đây chỉ đóng vai trò là chất trung hòa môi trường và đưa pH về vùng trung tính để cho vi khuẩn Bacillus phát triển và sinh enzyme tốt hơn.
3.9.1. Nghiên cứu nuôi vi khuẩn trong môi trường có CaCO3 thu
amylaza
Từ môi trường cơ sở chúng tôi cộng thêm 2% tinh bột tan, CaCO3 được khử trùng riêng, khi lên men mới được bổ sung vào
+ Bổ sung CaCO3 vào môi trường với nồng độ 1, 2, 3, 4%
+ Tiếp một vòng que giống rồi nuôi lắc ở nhiệt độ phòng với chế độ lắc là 125 vòng/ phút.
+ Lấy 0,5 ml dịch nuôi cấy trên cho vào giếng thạch sau đó đưa đi nuôi tiếp trong tủ ấm 350C, 24 giờ rồi đổ thuốc thử lên và quan sát vòng phân giải của chúng. Tiến hành đánh giá sự phát triển của chúng thông qua OD620nm. Kết quả được thể hiện ở các hình và bảng dưới đây:
Hình 14: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sinh enzyme trên môi trường có tinh bột tan của chủng Bs
Hình 15: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sinh enzyme trên môi trường có tinh bột tan của chủng Bm
Hình 16: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sinh enzyme trên môi trường có tinh bột tan của chủng BM
Bảng 3.9: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sự sinh trưởng trên môi trường có tinh bột của 3 chủng Bs, Bm và BM
Chủng vi khuẩn
Nồng độ
CaCO3 (%) Khả năng sinh trưởng (OD620nm)
Sau 24h Sau 30h Sau 36h Sau 42h
0 0,34 0,71 0,7 0,6 1 1,15 1,21 1,2 1,18 2 1,25 1,32 1,3 1,27 3 1,1 1,2 1,1 0,92 Bs 4 1,3 1,4 1,35 1,00 0 0,66 0,68 0,60 0,55 1 1,00 1,02 1,1 0,91 2 0,50 0,63 0,57 0,51 3 1,22 1,25 0,9 0,82 Bm 4 1,20 1,00 0,9 0,84 0 0,38 0,45 0,38 0,36 1 1,2 1,15 1,10 1,02 2 1,1 1,25 1,27 1,22 3 1,15 1,20 1,08 1,00 BM 4 1,1 1,21 1,2 1,17
Qua các hình 14, 15, 16 và bảng 3.9 chúng tôi nhận thấy ở nồng độ CaCO3 2% thì thích hợp cho sự sinh trưởng và sinh amylaza của 2 chủng Bs và BM, còn ở chủng Bm là CaCO3 3%. Khả năng sinh trưởng và sinh enzyme cao hơn ở môi trường không bổ sung CaCO3. Sự sinh trưởng tối đa xảy ra trước (24-30 giờ) khi sự sinh enzyme đạt tối đa (30-36 giờ).
3.9.2. Nghiên cứu nuôi vi khuẩn trong môi trường có CaCO3 thu proteaza
Từ môi trường cơ sở chúng tôi cộng thêm 3% cazein, CaCO3 được khử trùng riêng, khi lên men mới được bổ sung vào.
+ Bổ sung CaCO3 vào môi trường với nồng độ 1, 2, 3, 4%
+ Tiếp một vòng que giống rồi nuôi lắc ở nhiệt độ phòng với chế độ lắc là 125 vòng/ phút.
+ Lấy 0,5 ml dịch nuôi cấy trên cho vào giếng thạch sau đó đưa đi nuôi tiếp trong tủ ấm 350C, 24 giờ rồi đổ thuốc thử lên và quan sát vòng phân giải của chúng. Tiến hành đánh giá sự phát triển của chúng thông qua OD620nm. Kết quả được thể hiện ở các hình và bảng dưới đây:
Hình 17: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sinh enzyme trên môi trường có cazein của chủng Bs
Hình 18: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sinh enzyme trên môi trường có cazein của chủng Bm
Hình 19: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sinh enzyme trên môi trường có cazein của chủng BM
Bảng 3.10: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sự sinh trưởng trên môi trường có cazein của 3 chủng Bs, Bm và BM Chủng vi khuẩn Nồng độ CaCO3 (%)
Khả năng sinh trưởng (OD620nm)
Sau 24h Sau 30h Sau 36h Sau 42h
0 0,8 0,9 0,86 0,8 1 1,2 1,27 1,3 1,24 2 1,05 1,15 1,05 1,0 3 1,1 1,2 1,3 1,15 Bs 4 1,1 1,2 1,15 1,08 0 0,66 0,67 0,66 0,6 1 0,65 0,7 0,66 0,61 2 1,25 1,4 1,35 1,32 3 1,2 1,4 1,33 1,29 Bm 4 0,7 1,19 1,3 1,2 0 0,51 0,57 0,57 0,53 1 0,97 0,97 1,09 1,0 2 0,95 1,07 0,87 0,80 3 1,19 1,22 1,2 1,17 BM 4 1,18 1,2 1,2 1,16
Qua hình 17, 18, 19 và bảng 3.10 chúng tôi nhận thấy trong môi trường cazein có bổ sung CaCO3 thì ở nồng độ CaCO3 3% thích hợp nhất cho sự sinh enzyme proteaza của 2 chủng Bm và BM, với chủng Bs thì ở nồng độ CaCO3 2%. Khả năng sinh trưởng và sinh enzyme cao hơn ở môi trường cazein không bổ sung CaCO3. Sự sinh trưởng và sinh enzyme proteaza ngoại bào cũng tương tự như trường hợp sinh amylaza: sinh trưởng đạt mức tối đa (30 giờ) xảy ra trước khi sinh enzyme đạt mức tối đa (36 giờ).
Như vậy CaCO3 có vai trò điều chỉnh pH của môi trường, làm cho pH của môi trường nằm trong vùng hoạt động tối thích của chủng vi khuẩn
Bacillus, làm cho chủng vi khuẩn Bacillus sinh trưởng và sinh enzyme tốt
hơn.
3.10. Ảnh hưởng của nồng độ oxy hòa tan
Nồng độ oxy hòa tan trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật hiếu khí. Tuy nhiên ảnh hưởng này có khác nhau tùy từng loài, hầu hết là làm tăng tốc độ sinh trưởng , rút ngắn pha tiền phát, nâng cao lượng sinh khối nhưng trong một vài trường hợp thì thiếu oxy tuy có kìm hãm sinh trưởng nhưng lại gia tăng quá trình sinh tổng hợp enzyme.
Đối với 3 chủng Bs, Bm, BM, chúng tôi nghiên cứu nhu cầu sử dụng lượng oxy hòa tan thông qua thí nghiệm nuôi lắc riêng rẽ 3 chủng ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ với độ hiếu khí khác nhau từ 10 đến 40%. Độ hiếu khí được tính qua tỷ lệ thể tích môi trường lên men (v) so với thể tích bình chứa (V): . Kết quả thể hiện ở các bảng sau:
Bảng 3.11: Ảnh hưởng của độ hiếu khí lên khả năng sinh trưởng của 3 chủng Bs, Bm, BM Độ hiếu khí (%) Chủng vi khuẩn 10 20 30 40 Bs 0.84 0.72 0.56 0.44 Bm 0.7 0.56 0.5 0.35 BM 0.76 0.66 0.56 0.48
Ba chủng Bs, Bm, BM đều thuộc loại hiếu khí. Trong các thí nghiệm đối với các độ hiếu khí khác nhau, cả 3 chủng đều dao động. Cả 3 chủng Bs, Bm và BM đều phát triển mạnh ở độ thông khí dao động từ 10 – 20 % với OD620nm dao động từ 0,56 – 0,84 , nhưng phát triển
Ba chủng Bs, Bm, BM đều thuộc loại hiếu khí. Trong các thí nghiệm đối với các độ hiếu khí khác nhau, cả 3 chủng đều dao động. Cả 3 chủng Bs, Bm và BM đều phát triển mạnh ở độ thông khí dao động từ 10 – 20% với OD620nm dao động từ 0,56 – 0,84, nhưng phát triển mạnh nhất ở tỉ lệ 10% với OD620nm là 0,84 ở chủng Bs, OD620nm là 0,7 ở chủng Bm và 0,76 với chủng BM.
Bảng 3.12: Ảnh hưởng của độ hiếu khí tới khả năng sinh trưởng của 3 chủng Bs, Bm, BM trên môi trường có bổ sung CaCO3
Trên môi trường có bổ sung CaCO3 mật độ tế bào thể hiện rất cao và đều hơn ở 3 chủng. Ở cả 3 chủng mật độ tế bào thể hiện cao ở độ thông
Độ hiếu khí (%)
Chủng vi khuẩn 10 20 30 40
Bs 0,90 0,84 0,68 0.60
Bm 0,82 0,71 0,65 0,57
khí 10 – 20%, cao nhất ở độ thông khí là 10% với OD620nm là 0,9 với chủng Bs, OD620nm là 0,82 với chủng Bm và 0,89 với chủng
Trên môi trường có bổ sung CaCO3 mật độ tế bào thể hiện rất cao và đều hơn ở 3 chủng. Ở cả 3 chủng mật độ tế bào thể hiện cao ở độ thông khí 10 – 20%, cao nhất ở độ thông khí là 10% với OD620nm là 0,9 với chủng Bs, OD620nm là 0,82 với chủng Bm và 0,89 với chủng BM.
Xác định hoạt tính enzyme của các chủng ở các độ thông khí khác nhan trên môi trường có cơ chất cảm ứng bằng phương pháp đục lỗ thạch. Kết quả được thể hiện ở hình sau:
Hình 20: Ảnh hưởng của độ hiếu khí lên hoạt tính enzyme amylaza của 3 chủng Bs, Bm và BM trên ở môi trường có bổ sung CaCO3
Hình 21: Ảnh hưởng của độ hiếu khí lên hoạt tính enzyme proteaza của 3 chủng Bs, Bm và BM trên ở môi trường có bổ sung CaCO3
Từ hai hình 3.20 và 3.21 chúng tôi nhận thấy hoạt tính enzyme thể hiện càng cao ở độ hiếu khí càng lớn.
Vậy độ hiếu khí thích hợp để nuôi cấy 3 chủng là 10 – 20%
3.11. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH tới sự sinh trưởng và phát triển của ba chủng nghiên cứu
Ba chủng vi khuẩn Bs, Bm và BM sau 24 giờ nhân giống trên môi trường cơ sở đươc cấy vào môi trường có pH thay đổi 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 với tốc độ lắc 125 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Sau 36 giờ kiểm tra đánh giá khả năng phát triển của chúng bằng cách đo OD620nm. Kết quả thu được dưới h́nh sau:
Hình 22: Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng Bs, Bm và BM
Từ hình 22 cho thấy khi pH dao động từ 4 – 5 thì cả 3 chủng phát triển yếu: OD620nm thấp, chỉ đạt 0,34 ở Bm; 0,41 ở chủng Bs và 0,45 ở chủng BM. Khi pH tăng từ 6 – 8 đặc biệt ở khoảng giữa 7 – 8 thì cả 3 chủng bắt đầu phát triển mạnh, mật độ tế bào đạt giá trị cao nhất tại pH = 7 với OD620nm lần lượt là 0,80 và 0,81 của chủng Bs và BM, ở pH = 8 thì OD620nm là 0,80 của chủng Bm. Ba chủng phát triển có phần ổn đinh ở pH = 9, nhưng tới 10 thì hầu như yếu dần OD620nm dao động từ 0,41 tới 0,47. Như vậy pH ban đầu thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của cả ba chủng là từ 7 – 8.
3.12. Nghiên cứu sử dụng bột đậu tương làm nguồn nguyên liệu thay thế
Từ môi trường cơ sở chúng tôi bổ sung bột đậu tương ở các nồng độ: 1, 2, 3, 4% và được cấy 1-2% chủng vi khuẩn rồi đưa đi lắc ở vận tốc 125 vòng/phút, nhiệt độ phòng, với thời gian là 36 giờ . Tiến hành đục lỗ
thạch rồi quan sát đo vòng phân giải của hai enzyme chúng tôi thu được kết quả như sau:
Bảng 3.13: Ảnh hưởng của bột đậu tương lên khả năng sinh proteaza, amylaza của ba chủng Bs, Bm, BM
Chủng vi khuẩn Nồng độ bột đậu tương
(%) Hoạt tính enzyme (D-d)mm Proteaza Amylaza 1 21,5 13 2 20 13 3 26 14 Bs 4 21 13,5 1 6 6 2 8 6 3 16 12 Bm 4 11 7 1 13 8 2 12 8 3 14 8,5 BM 4 10 7,5
Từ bảng trên chúng tôi nhận thấy nồng độ bột đậu tương mà tại đó 3
chủng nghiên cứu cho hoạt tính enzyme cao nhất là 3% tức là 30 g/lít môi
trường.
Trên môi trường cơ sở chúng tôi đã thay glucose bằng bột đậu tương 3% sau đo cho thêm CaCO3 ở các nồng độ khác nhau: 1, 2, 3 và 4% làm chất điều chỉnh pH.
Giống được tiếp với tỉ lệ 1-2%, đưa đi lắc ở 125 vòng/phút trong 36 giờ. Sau đó tiến hành đục lỗ thạch rồi quan sát đo vòng phân giải của hai enzyme chúng tôi thu được kết quả như sau:
Bảng 3.14: Ảnh hưởng của nồng độ CaCO3 đến khả năng sinh amylaza, proteaza trên môi trường có bột đậu tương
Chủng vi khuẩn Nồng độ CaCO3 (%) Hoạt tính enzyme (D-d)mm Protease Amylase 0 26 14 1 18 16 2 26 15 3 25 19 Bs 4 20 14 0 16 12 1 18 10 2 18 10 3 22 14 Bm 4 11 11 0 14 8,5 1 23 8 2 25 8 3 21 12 BM 4 18 7,5
Qua 2 bảng 3.13 và 3.14 chúng tôi nhận thấy ở nồng độ CaCO3 2% thích hợp cho sự sinh proteaza của 2 chủng Bs và BM, nồng độ CaCO3 3% thích hợp cho sự sinh trưởng của chủng Bm. Hoạt tính amylaza đạt cực đại ở nồng độ CaCO3 3% đối với cả 3 chủng Bs, Bm và BM. Hoạt tính 2 enzyme đều thể hiện cao hơn ở môi trường chỉ có bột đậu tương. Tuy vậy CaCO3 ở nồng độ cao sẽ ức chế quá trình sinh enzyme của cả 3 chủng.
Cũng qua bảng trên chúng tôi nhận thấy chủng vi khuẩn Bs là có hoạt tính mạnh nhất, thích hợp nhất với bột đậu tương.
Bột đậu tương có hàm lượng protein chiếm khoảng 30 – 35% và có khoảng 40% là tinh bột. Vì vậy bột đậu tương đóng vai trò là chất cảm ứng của hai enzyme amylaza và proteaza. Kết quả thí nghiệm cho thấy trên môi trường có bột đậu tương thì sự sinh trưởng và biểu hiện hoạt tính 2 enzyme amylaza và proteaza là lớn nhất.
Nuôi Bs, Bm và BM trên môi trường (thành phần dưới đây cho 1 lít môi trường) sẽ thu được cả hai enzyme amylaza và proteaza. Trong thực tế sản xuất công nghiệp chúng ta có thể dùng bột đậu tương làm nguồn nguyên liệu cơ bản để sản xuất enzyme.
Bột đậu tương 30 g
Peptone 5 g
Cao men 2,5 g
CaCO3 2%
pH = 7 – 8
3.13. Nghiên cứu đồ thị tổng hợp động học của quá trình lên men
