2.2.2.1. Phương pháp kiểm tra mật độ vi sinh vật [9]
Cân 10g mẫu vào bình tam giác dung tích 250ml có chứa 90ml nước cất đã khử trùng. Lắc trên máy lắc 150 vòng/phút trong 30 phút, thu được dịch pha loãng có nồng độ là 10-1. Sau đó, hút 1ml dịch trong bình pha loãng nồng độ 10-1 sang ống nước cất 9ml đã khử trùng, được nồng độ pha loãng 10-2. Tiếp tục pha loãng như trên, được
nồng độ pha loãng 10-3, 10-4…, đến nồng độ pha loãng cần thiết. Hút 0,05ml dịch đã
pha loãng nhỏ vào các hộp petri chứa môi trường thạch phù hợp. Dùng que trang thuỷ t0C
Nguyễn Thị Hằng Nga 38 Cao học Môi trường K15
tinh (đã vô trùng), trang đều lên mặt môi trường trong hộp petri. Sau khi trang xong
dùng giấy gói lại và chuyển các hộp petri chứa vi sinh vật vào tủ ấm và nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ thích hợp. Sau khoảng từ 2- 4 ngày nuôi cấy, lấy mẫu ra quan sát và đếm số khuẩn lạc mọc trên các hộp petri. Số lượng khuẩn lạc được tớnh bằng công thức:
N = ) 1 , 0 (n1 n2 d C + ∑ Trong đó:
N: là số vi sinh vật trong một đơn vị kiểm tra (CFU/g (ml));
∑C: là tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa Petri được giữ lại;
n1: là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất;
n2: là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ hai;
d : là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất.
Kiểm tra mật độ xạ khuẩn: Kiểm tra trên môi trường Gause (A1), các bước tiến hành tương tự như trên
Kiểm tra mật độ nấm men: Kiểm tra trên môi trường Hansen (A2), các bước tiến hành tương tự như trên
2.2.2.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học vi sinh vật
Phương pháp xác định hoạt tính phân giải cellulose [8]
Xác định hoạt tính phân giải cellulosebằng phương pháp khuyếch tán trên thạch
đĩa.
Nguyên tắc của phương pháp: enzym celluloseza thuỷ phân CMC trong môi trường sẽ tạo vòng thuỷ phân có màu vàng xung quanh lỗ đục đã được nhỏ dịch vi sinh vật và hiện màu bằng dung dịch lugol. Dựa vào hệ số giữa đường kính vòng thuỷ phân
(D) và đường kính đục lỗ (d) người ta xác định được hoạt tính CMC- aza của vi sinh
vật.
Phương pháp được tiến hành cụ thể như sau:
Nguyễn Thị Hằng Nga 39 Cao học Môi trường K15 • Đổ dịch lỏng vào hộp petri có chiều dày là 1,5cm.
• Dùng dụng cụ đục một lỗ tròn (đường kính 10mm) vào giữa hộp petri chứa môi
trường CMC.
• Nhỏ 0,1ml dịch enzym đã ly tâm vào lỗ được đục. Sau đó, chờ dịch khô, chuyển
các hộp petri vào tủ lạnh (từ 6-8 giờ) để enzym khuyếch tán. Chuyển vào tủ ấm ở nhiệt độ 370C để enzym tác dụng với cơ chất CMC.
• Cho vào mỗi hộp petri 5ml dịch lugol (Cân 2g KI và 1g I2 vào 300ml nước cất),
tráng đều lên mặt thạch và chờ khoảng 15 phút. Sau đó, gạt bỏ hết dịch lugol, quan sát vòng khuyếch tán.
• Dùng thước kẻ, đo vòng CMC bị phân giải xung quang lỗ (vùng màu vàng trên
nền đen tím).
Hoạt tính CMC- aza được hiển thị bằng hiệu số giữa đường kính vòng phân giải (D) và đường kính lỗ khoan ( d ), (D- d) đơn vị đo là mm.