NaCl 90/00
3.3.2.1. Phân lập vi khuẩn Lactobacillus acidophilus
Mẫu phân lập: sử dụng chế phẩm Antibio chứa vi khuẩn Lactobacillus acidophilus do
Hàn Quốc sản xuất.
Quy trình phân lập:
Cách tiến hành
Cho 1 gam chế phẩm Antibio hòa vào 9 ml nước muối sinh lý (nồng độ 9 o/oo) sau đó lắc đều sao cho dung dịch trở nên đồng nhất ta được dung dịch có nồng độ pha loãng 10-1. Tiếp theo lấy 1ml dung dịch 10-1 cho vào 9 ml dung dịch NaCl 9 o/oo ta được dung dịch có nồng độ 10-2. Tiếp tục như thế cho đến khi được các dung dịch có nồng độ 10-6, 10-7. Dùng micropipet hút 0,2 ml dịch khuẩn ở nồng độ 10-6, 10-7 (mỗi nồng độ cho vào 2 đĩa) trang đều trên mặt thạch chứa môi trường MRSA sau đó đem ủ ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ và chọn khuẩn lạc nghi ngờ (khuẩn lạc tròn đều, nhô lên và bên ngoài có vòng trong)
10-2 10-3
10-1
Môi trường phân lập MRSA
Cấy giữ giống
Chọn khuẩn lạc điển hình, nhuộm Gram và thử các phản
ứng sinh hóa
Môi trường giữ giống MRSA
đem nhuộm Gram và cấy giữ giống. Những khuẩn lạc nghi ngờ này được tăng sinh trong môi trường MRSB trong 24 giờ ở nhiệt độ 37oC để tiến hành thử các phản ứng sinh hóa.
Xác định vi khuẩn Lactobacillus acidophilus
Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus xác định dựa trên các phương pháp truyền thống như:
o Quan sát hình dạng tế bào khuẩn lạc và sự bắt màu khi nhuộm Gram.
o Thử nghiệm bằng các phản ứng sinh hóa.
Phản ứng Kết quả Lên men
đường Kết quả Indol VP MR Citrat Nitrat Di động Catalase
Khả năng đông vón sữa
Lactose Sucrose Glucose Manitol Rabinose
3.3.2.2. Khảo sát số lượng tế bào vi khuẩn và độ chua Therne trên môi trường sữa đặc có đường
Giống L. acidophilus sau khi phân lập được tăng sinh trên môi trường MRSB trong thời gian 24 giờ ở 37oC. Sau đó cho lượng giống 5 % vừa tăng sinh này vào môi trường sữa đặc có đường với từng nồng độ là:15%, 20% và 25% sữa. Sau thời gian nuôi 24 giờ với pH = 6,5 - 7 ở nhiệt độ phòng chúng tôi tiến hành kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn và độ chua Therne của từng loại môi trường.
Nồng độ sữa (%)
Độ chua Therne (g) Số lượng tế bào vi khuẩn
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3
15 20 25
3.3.2.3. Khảo sát số lượng tế bào vi khuẩn và độ chua Therne trên môi trường sữa đậu nành
Tương tự như ở thí nghiệm 3.3.2.2 sử dụng 5% giống cho vào môi trường sữa đậu nành với nồng độ đậu nành là 10%, 15% và 20%. Ứng với mỗi nồng độ đậu chúng tôi khảo sát từng nồng độ đường cho vào là 0%, 10%, 15% và 20%. Những nồng độ này được ký hiệu như sau:
o Ở nồng độ 10% đậu có bổ sung từng hàm lượng đường là 0%,10%,15% và 20% được ký hiệu lần lượt là NA0, NA10, NA15, NA20.
o Tương tự ở nồng độ 15% đậu có: NB0, NB10, NB15 và NB20.
o Ở nồng độ 20% đậu có: NC0, NC10, NC15 và NC20.
Sau thời gian nuôi cấy là 24 giờ, pH = 6,5 - 7 ở nhiệt độ phòng chúng tôi tiến hành kiểm tra độ chua Therne và số lượng tế bào vi khuẩn tương tự như thí nghiệm 3.3.2.2.
Nồng độ
đậu nành hiệu Kí
Độ chua Therne Số lượng tế bào vi khuẩn
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 10% NA0 NA10 NA15 NA20 15% NB0 NB10 NB15 NB20 20% NC0 NC10 NC15 NC20
3.3.2.4. Tiến hành sản xuất thử chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus
Từ kết quả khảo sát độ chua và số lượng tế bào vi khuẩn ở hai loại môi trường sữa đặc có đường và sữa đậu nành chúng tôi chọn được môi trường tối ưu nhất để tiến hành sản xuất thử chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus.
Sau 24 giờ nuôi trên môi trường tối ưu ở nhiệt độ phòng với lượng giống cho vào là 5%. Chúng tôi bắt đầu thu hoạch và đem phối trộn với bột đậu nành khô đã qua khử
trùng (sấy 100oC trong 2giờ). Tỷ lệ phối trộn là 1:1 sau đó đem sấy ở nhiệt độ 40 - 45oC trong 2 ngày sao cho sản phẩm khô hoàn toàn. Sản phẩm này được xây mịn, đóng gói sau đó đem kiểm tra và bảo quản ở nhiệt độ phòng.
3.3.2.5. Kiểm tra sản phẩm sau thời gian bảo quản
Sản phẩm sau khi sấy khô chúng tôi tiến hành kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn có trong 1 gam sản phẩm và sau thời gian bảo quản 10 và 20 ngày bằng phương pháp đếm số lượng tế bào sống trên thạch (được trình bày chi tiết ở mục 3.5 phần phụ lục).
3.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU3.4.1. Xử lý số liệu 3.4.1. Xử lý số liệu
Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Minitab release 13.20 để so sánh sự khác biệt giữa các môi trường.
Đối với thí nghiệm trên Bacillus subtilis
Môi trường nhân giống cấp 1 và môi trường nhân giống cấp 2 chúng tôi dùng dùng trắc nghiệm 1 yếu tố để xem tác động của:
Môi trường lên số lượng tế bào vi khuẩn Môi trường lên hoạt độ enzyme amylase Môi trường lên hoạt độ enzyme protease
Đối với thí nghiệm trên Lactobacillus acidophilus
Môi trường sữa đặc có đường dùng trắc nghiệm một yếu tố để xem ảnh hưởng của nồng độ sữa lên số lượng và độ chua của L. acidophilus.
Môi trường sữa đậu nành dùng trắc nghiệm hai yếu tố là nồng độ đậu nành và hàm lượng đường trong sữa đậu nành để:
So sánh sự khác biệt giữa từng nồng độ đậu và từng hàm lượng đường lên số lượng và độ chua Therne của sữa.
Ảnh hưởng của nồng độ đậu và hàm lượng đường lên số lượng và độ chua của sữa.
3.4.2. Biểu đồ