Nguyên tắc
Độc tố VT2e mất khả năng gây độc trên tế bào vero do bị trung hoà bởi kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB.
Tiến hành
Kháng huyết thanh pha loãng bậc hai được ủ với một liều độc tố xác định VT2e+ ở 37oC trong một giờ và ở 4oC qua đêm. Cấy hỗn hợp kháng huyết thanh - độc tốđã ủ vào phiến 96 giếng chứa tế bào vero đã nuôi cấy 24g. Tiếp tục nuôi tế bào vero ở 37oC thêm 2 ngày. Quan sát sự huỷ hoại tế bào do verotoxin không bị trung hoà hàng ngày và ghi nhận kết quả trong 2 ngày.
Phản ứng trung hoà độc tố
- Đối chứng (+): là những giếng chỉ có tế bào vero.
- Đối chứng (-): là những giếng được ủ với 100 µl dịch lọc vi khuẩn có nồng
độ TCID50đã xác định ở trên.
- Đối chứng tế bào: là những giếng được ủ với 100 µl kháng huyết thanh chưa pha loãng.
- Đánh giá kết quả:
Quan sát sự huỷ hoại tế bào do verotoxin không bị trung hoà hàng ngày tại các thời điểm 24g và 48g. Sau 48g, tiến hành nhuộm tế bào, đọc kết quả bằng máy spectrophotometer ở bước sóng 620 nm và xác định hiệu giá kháng thể bằng phương pháp Reed – Muench.
Những giếng có kết quả dương tính là những giếng có sự huỷ hoại tế bào dưới 50% so với giếng đối chứng huyết thanh.
Những giếng có kết quả âm tính là những giếng có sự huỷ hoại tế bào trên 50% so với giếng đối chứng huyết thanh.
Hút 100 µl môi trường DMEM vào mỗi giếng trên phiến 96 giếng
Hút 100 µl kháng huyết thanh vào cột 1 trên phiến 96 giếng. Tiếp tục pha loãng kháng huyết thanh từ nồng độ ½ đến nồng độ 1/2048
Thêm 100 µl dịch lọc vi khuẩn ở liều 3TCID50 vào mỗi giếng
Ủở 37oC trong 1giờ, 4oC qua đêm
Hút 100 µl hỗn hợp trên cho vào mỗi giếng trên phiến 96 giếng chứa tế bào vero đã nuôi cấy 24g
Ủở 37oC, 5% CO2 trong 24 – 48g
Quan sát dưới kính hiển vi, tiến hành nhuộm tế bào, đọc kết quả và xác định hiệu giá kháng thể trung hoà độc tố VT2e