verotoxin trên tế bào vero.
Phƣơng pháp trung hòa độc tố verotoxin trên tế bào vero đƣợc sử dụng rộng rãi trong việc đánh giá hiệu giá của kháng huyết thanh mang kháng thể của độc tố vero. Nguyên tắc của phản ứng này nhƣ sau:
Trên tế bào vero, độc tố verotoxin sẽ liên kết với các thụ thể đặc hiệu có trên màng tế bào rồi cản trở sự tổng hợp protein của tế bào gây chết tế bào. Nếu độc tố này đƣợc ủ với kháng huyết thanh chứa kháng thể của độc tố này, thì kháng thể có trong huyết thanh sẽ liên kết với độc tố làm bất hoạt độc tố và tế bào không bị chết. Dựa trên sự quan sát độ phân tách của tế bào ngƣời ta có thể biết đƣợc là nó chết hay không. Căn cứ trên nồng độ huyết thanh trung hòa đƣợc lƣợng độc tố ở liều
TCID50 ngƣời ta có thể xác định hiệu giá kháng huyết thanh và đánh giá hiệu quả
của vacxin.
Protein MBP-VT2eB đƣợc tạo ra dựa trên tiểu phần B của độc tố VT2e qui định khả năng liên kết với các thụ thể đặc trƣng trên tế bào đích. Do đó khi tiêm protein MBP-VT2eB trên heo thì heo sẽ tạo ra kháng thể chống lại tiểu phần B của độc tố VT2e. Do đó, độc tố này không có khả năng liên kết với các thụ thể đặc hiệu trên tế bào gốc nên mất khả năng gây bệnh. Dựa trên phản ứng trung hòa độc tố verotoxin trên tế bào vero, có thể xác định hiệu giá kháng huyết thanh. Nhờ đó đánh giá đƣợc khả năng gây đáp ứng miễn dịch của protein MBP-VT2eB trên heo.
18
PHẦN 3
NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM
- Thời gian : từ 1/3/2005 đến 30/7/2005 - Địa điểm thực hiện:
Trại chăn nuôi heo của anh Thắng ở ấp 8, xã Tân Thạnh Đông, huyện Củ Chi.
Trung tâm phân tích thí nghiệm trƣờng ĐH Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
Phòng kiểm định vacxin viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh.
3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Tiêm protein tái tổ hợp trên MBP-VT2e trên heo con theo mẹ và đánh giá độ an toàn của dịch tiêm.
- Khảo sát liều TCID50 của độc tố VT2e trên tế bào vero.
- Khảo sát hiệu giá kháng thể kháng MBP- VT2e theo phƣơng pháp khuyếch tán trên thạch.
- Khảo sát hiệu giá kháng thể kháng MBP-VT2e bằng phƣơng pháp trung hòa độc tố trên tế bào vero.
3.3 VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM 3.3.1 Vật liệu và thú thí nghiệm 3.3.1 Vật liệu và thú thí nghiệm
- Heo con theo mẹ: 25 con.
- Máu heo thí nghiệm
- Vi khuẩn E. coli sinh độc tố VT2e O138:K28 (H28)
- Vi khuẩn E. coli không sinh độc tố VT2e (DH5 )
- Tế bào vero
3.3.2 Hóa chất thí nghiệm
- Chất bổ trợ Al(OH)3
- Môi trƣờng nuôi cấy tế bào vero DMEM
- Trypsin 0,5%
- Versene 0,2%
- Huyết thanh bê (Fetal calf serum: FCS)
- Môi trƣờng lactose broth
19
- Phenol
- Muối NaCl, muối NaH2PO4.2H2O, muối NaHPO4.12H2O
- Dung dịch đệm PBS (phosphate buffer saline)
- Sodium azid NaN3.
- Protein tái tổ hợp MBP-VT2eB
- Đệm borat
- Formol
- Thuốc nhuộm xanh methylene
- Nƣớc cất 3.3.3 Dụng cụ thí nghiệm - Syringe vô trùng 1ml và 5ml - Effendof 1,5ml - Tủ cấy vô trùng - Máy li tâm lạnh - Tủ ấm CO2
- Đĩa polystyren 96 giếng
- Miếng plastic dán đĩa polystyren
- Chai nuôi tế bào Roux 25, 80cm2
- Pippete man
- Pippete Pasteur
- Đầu côn 1000 l,100 l
- Ống thủy tinh 3ml
- Máng nhựa tiệt trùng
- Kính hiển vi soi ngƣợc IOD3
- Máy Spectrophotomer
- Buồng đếm hồng cầu GASSALEM
- Tủ lạnh 2-8oC, tủ lạnh -20o C - Đĩa petri 3cm - Dụng cụ đục lỗ - Lò microwave - Cân phân tích
20
3.4 PHƢƠNG PHÁP 3.4.1 Bố trí thí nghiệm
- Tiến hành khảo sát trên 5 lô, số lƣợng heo con 5 cá thể/lô, phân bố ngẫu nhiên
từ heo con lớn nhất trong bầy của 5 nái:
Lô 1: lô đối chứng không tiêm vac-xin chỉ tiêm chất bổ trợ.
Lô 2: tiến hành tiêm 1 lần vào lúc 14 ngày tuổi với liều 50 g protein tái tổ
hợp/ml.
Lô 3: tiêm 2 lần vào lúc 14 ngày tuổi và 24 ngày tuổi với liều 50 g protein tái
tổ hợp/ml.
Lô 4: tiến hành tiêm 1 lần vào lúc 14 ngày tuổi với liều 75 g protein tái tổ
hợp/ml.
Lô 5: tiêm 2 lần vào lúc 14 ngày tuổi và 24 ngày tuổi với liều 75 g protein tái
tổ hợp/ml.
Lô 1* 2 3 4 5
Liều tiêm( g/ml) 0 50 50 75 75
Số lần tiêm 0 1 2 1 2
*: tiêm chất bổ trợ Al(OH)3 2 lần, 1ml/con
3.4.2 Cách pha dịch tiêm
- Chuẩn bị dịch Al(OH)3 vô trùng
- Pha liều protein tái tổ hợp với thể tích tƣơng ứng với Al(OH)3 để đạt hàm lƣợng
50 g hay 75 g protein tái tổ hợp/ml.
Sau đó lắc đều trong thời gian 45 phút. Phân phối vào các chai nhỏ 2 liều/ chai
bảo quản ở 4oC cho đến khi tiêm.
- Mỗi lần tiêm 1ml. Tiêm bắp.
3.4.3 Lấy máu
Máu đƣợc lấy ngay trƣớc khi tiêm và mỗi tuần một lần sau khi tiêm ở tất cả các cá thể thí nghiệm cho đến 42 ngày tuổi.
Lấy máu heo: dùng syringe lấy 1ml máu ở xoang tĩnh mạch cổ. Sau đó để 4oC
21
2 phần: cho sodium azid NaN3 khoảng 0,05% bảo quản ở 4oC một phần, phần kia
không bổ sung sodium azid NaN3 bảo quản ở -20oC.
3.4.4 Định tính kháng thể bằng phƣơng pháp Ouchterlony
Phƣơng pháp tiến hành: [18]
Chuẩn bị giá thạch:
- Cân 1,125 g agarose và 8g NaCl cho vào 100ml dung dịch nƣớc cất khử ion.
Nấu sôi ở 100oC cho đến khi agarose tan hoàn toàn đƣợc dung dịch trong suốt.
Sau đó cho 500μl phenol, lắc cho phenol tan đều.
- Để nguội khoảng 60oC, rồi đem rót vào các đĩa Petri có đƣờng kính 3cm, để
cho thạch đông cứng rồi tiến hành đục một giếng trung tâm và 6 giếng xung quanh với chiều cao 1,5mm, đƣờng kính là 6mm và khoảng cách giữa các giếng là 5mm.
Tiến hành lót mẫu: theo 2 cách
- Kháng nguyên là dịch độc tố VT2e (đƣợc thu nhƣ dùng trong phản ứng
trung hòa độc tố mục 3.4.5) hay protein tái tổ hợp MBP-VT2eB (nồng độ 0.38mg/ml) với các độ pha loãng từ 1, 1/2, 1/4, …,1/32 đƣợc cho vào các giếng xung quanh, kháng huyết thanh đƣợc cho vào giếng trung tâm.
- Kháng nguyên đƣợc cho vào giếng trung tâm và kháng huyết thanh đƣợc
cho vào ở các giếng xung quanh.
Đem đĩa petri này bỏ vào trong một hộp nhựa kín có lót giấy thấm nƣớc để giữ ẩm. Đem ủ ở nhiệt độ phòng, rồi đọc kết quả trong 24g -48g.
Cách đọc kết quả:
Quan sát trên đĩa, nếu ở vị trí nào có một đƣờng cong mờ đục (hình 3.1) thì ở giếng đó cho kết quả dƣơng tính nghĩa là ở độ pha loãng đó kháng huyết thanh này có chứa kháng thể tƣơng ứng và hàm lƣợng kháng thể tƣơng đƣơng. Các đƣờng cong do vạch kết tủa tạo ra có thể có hình dạng khác nhau( hình 3.2)
Phản ứng dƣơng tính hoàn toàn (complete identity) (+): nếu hai kháng nguyên giống nhau hay có hai epitop tƣơng tự, cung kết tủa kháng thể có đặc tính liên tục.
Phản ứng âm tính (non- identity) (-): nếu hai kháng nguyên khác nhau thì chúng sẽ kết hợp với hai kháng thể tạo ra cung kết tủa bắt chéo nhau.
22
Phản ứng dƣơng tính một phần (partial identity) (±): nếu hai kháng thể có một epitop chung và một epitop riêng cho mỗi loại thì sẽ thấy một cung kết tủa bổ sung tạo ra nhánh có kháng nguyên thứ hai [5].
3.4.5 Xác định liều TCID50
3.4.5.1 Chuẩn bị dịch độc tố
Vi khuẩn E. coli dòng O139:K82 có gen qui định độc tố VT2e đƣợc nuôi
cấy trong môi trƣờng lactose broth, ở 37oC lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ. Dịch
nuôi cấy đem ly tâm 10000 vòng/30 phút, thu dịch trong đem lọc qua màng lọc 0,45 m để thử độc tố trên tế bào vero.
3.4.5.2 Chuẩn bị tế bào vero
Tế bào vero sẽ đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng Eagle minimum, bổ sung
10% huyết thanh bê, 2mM gentamycin trong các chai nhỏ ở 37o
C, 5% CO2 [12].
Các tế bào này sẽ đƣợc chuyển vào các đĩa 96 giếng theo các bƣớc sau: + Đổ bỏ môi trƣờng cũ trong chai.
+ Rửa lớp tế bào 2 lần bằng versene 0,2% để loại bỏ các tế bào chết.
(-)
Vạch kết tủa (+)
KN (hay KT) KT (hay KN)
Hình 3.1 Phản ứng dƣơng tính của phản ứng kết tủa khuyếch tán trên thạch.
(http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/AT P/immu2.htm)
Hình 3.2 Hình dạng các vạch kết tủa của phản ứng kết tủa khuyếch tán trên thạch. An: antigen, Ab: antibody.
(+)
(-)
23
+ Rửa tế bào 2 lần với trypsin 0,5% cho vào trong chai, loại bỏ trypsin chỉ giữ lại 1-2 giọt để giữ ẩm bế mặt tế bào.
+ Ủ trong tủ ấm 2-3 phút.
+ Sau đó hút 2 ml môi trƣờng DMEM có 10% huyết thanh bê cho chảy trên thành chai nhiều lần để phân tách tất cả tế bào vero ra khỏi thành chai. Hút 0,2ml đem đếm. Tiếp tục pha loãng bằng môi trƣờng DMEM để nồng độ tế bào là 300.000 tế bào/ml và nồng độ huyết thanh là 10%. Đem phân vào đĩa 96 giếng, ủ
ở 34oC trong 24 giờ. Nếu còn dƣ tế bào thì tiếp tục cho môi trƣờng DMEM có
10% huyết thanh bê rồi chuyển sang chai mới để tiếp tục nuôi cấy.
24
Sơ đồ 3.1: Xác định liều TCID50 của dịch lọc vi khuẩn đối với tế bào vero
Đối chứng (-)1: giếng chỉ chứa môi trƣờng nuôi cấy tế bào.
Đối chứng (-)2: giếng có dịch lọc canh khuẩn E. coli DH5α không chứa độc
tố VT2e.
Đổ bỏ môi trƣờng. Tráng 1 lần bằng dung dịch đệm PBS
Hút 100 l dịch lọc canh khuẩn ở mỗi nồng độ pha loãng trên vào mỗi giếng.
Ủ 37oC, 5% CO2 từ 1-2 ngày
Dịch thu từ huyễn dịch vi khuẩn E. coli dòng O139: K82 nuôi cấy ở trên đƣợc
pha loãng theo tỷ lệ 1/2, 1/20, 1/200… trong môi trƣờng DMEM.
Đọc độ hấp thụ bằng máy Spectrophotometre ở bƣớc sóng 620nm
Cho vào mỗi giếng 200µl formalin 2% trong PBS 0,067M (pH 7,2) trong 1 giờ
Cho vào mỗi giếng 100µl/giếng thuốc nhuộm blue methylene đƣợc pha loãng trong dung dịch đệm borat 0,01M
Đổ formol, tráng qua các giếng 2 lần bằng dung dịch đệm borat 0,01M, pH 8,5
Đổ bỏ thuốc nhuộm. Tráng 5 lần bằng nƣớc khử ion. Rửa 4 lần với ethanol 50% pha loãng trong 0,9ml đệm PBS để loại bỏ thuốc nhuộm
Để đĩa khô ở 37oC trong 1 giờ
Xác định liều TCID50
Quan sát trực tiếp dƣới kính hiển vi ở các thời điểm 24giờ, 48giờ. Những giếng dƣơng tính là những giếng có sự phân tách tế bào
25
- Kết quả ghi nhận: nồng độ TCID50 là nồng độ gây chết 50% tế bào vero nghĩa
là giá trị OD 50% so với OD của giếng đối chứng (-)1.
3.4.6 Thực hiện phản ứng trung hòa độc tố [8], sơ đồ 3.2
Tiến hành ủ độc tố với huyết thanh trên đĩa 96 giếng nhƣ sau:
Hút100 l dungdịch môi trƣờng nuôi cấy tế bào cho vào mỗi giếng. Sau đó hút 100 l huyết thanh cho vào giếng đầu tiên rồi hút 100 l từ giếng này cho vào các giếng tiếp theo. Pha loãng cho đến khi nồng độ đạt 1/152. Tiến hành tƣơng tự cho các mẫu huyết thanh còn lại, mỗi một mẫu là một hàng. Tiếp theo cho
100 l dịch độc tố có nồng độ 10TCID50 vào tất cả các giếng, dán giấy plastic rối
đem ủ ở 37oC trong 24g.
Tiến hành trung hòa độc tố trên môi trƣờng nuôi cấy tế bào vero:
Hút 100 l hỗn hợp huyết thanh và độc tố đã chuẩn bị nhƣ ở mục 3.4.5.1cho vào các giếng tế bào đã đƣợc chuẩn bị nhƣ ở mục 3.4.4.2. Mỗi hàng sẽ là một mẫu huyết thanh theo trình tự nồng độ pha loãng tăng dần, mỗi mẫu tiến hành trên hai hàng giếng. Đối chứng dƣơng là những giếng chỉ có tế bào vero, đối
chứng âm là những giếng ủ với dịch độc tố có nồng độ TCID50 đã xác định. Ủ
37oC trong 5% CO2. Quan sát hình thái tế bào dƣới kính hiển vi ở các thời điểm
24g và 48g.
Sau đó tiến hành nhuộm với xanh methylene nhƣ các bƣớc đƣợc mô tả ở mục 3.4.5
26
Sơ đồ 3.2: Thử nghiệm trung hòa độc tố trên tế bào vero
3.5 CÁC CHỈ TIÊU THEO DÕI
- Các triệu chứng shock phản vệ khi tiêm vac-xin vào nhƣ dị ứng, sốt,... có hay không
- Liều TCID50 tính theo công thức Reed- Muench
- Hiệu giá kháng thể trung hòa có trong kháng huyết thanh
- Xử lý số liệu bằng trắc nghiệm F trên phần mềm Statgraphic 7.0
Hút 100 l huyết thanh heo thí nghiệm pha loãng với 100 l dung dịch môi trƣờng nuôi cấy tế bào.Tiếp tục pha loãng cho đến nồng độ từ 1/2 1/152
Hút 100 l hỗn hợp này vào mỗi giếng đã đƣợc nuôi cấy tế bào vero để kiểm tra phản ứng trung hòa độc tố. Đối chứng (+) là những giếng chỉ có tế bào vero, đối
chứng (-) là giếng đƣợc ủ với 100 l dịch lọc vi khuẩn có nồng độ TCID50 đã xác
định.
Ủ 37oC trong CO2 5% trong 48-72g
Ủ huyết thanh với độc tố ở 37oC trong 1g, ủ ở 4o
C trong 24g
Đánh giá kết quả bằng cách quan sát dƣới kính hiển vi, nhuộm , đọc kết quả và xác định hiệu giá kháng huyết thanh trung hòa độc tố VT2e
27
PHẦN 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 ĐÁNH GIÁ ĐỘ AN TOÀN CỦA VACXIN
Theo dõi heo con sau khi tiêm vacxin 24 giờ thì không thấy có các phản ứng shock phản vệ nhƣ sốt, biếng ăn, dị ứng… xảy ra.
Theo dõi tăng trọng của heo con trong 5 tuần thấy tăng trọng trung bình của heo con tuy có khác nhau nhƣng không có ý nghĩa về mặt thống kê giữa các lô thí nghiệm (P>0.05)
Bảng 4.1: Tăng trọng của heo con trong thời gian thí nghiệm Lô Trọng lƣợng trung bình heo
con lúc 2 tuần tuổi (kg/con)
Trọng lƣợng trung bình heo con lúc 7 tuần tuổi (kg/con)
Tăng trọng bình quân heo con (kg/con)
1 3,96 ± 1,083 10,6 ± 1,817 6,74 ± 0,873
2 3,83 ± 0,153 9,67 ± 1,53 5,84 ± 1,46
3 4,15 ± 0,404 10,75 ± 1,9 7,12 ± 0,44
4 3,78 ± 0,23 10,9 ± 0,89 7,12 ± 0,44
5 3,67 ± 0,96 10,5± 1,73 6,82 ± 1,11
Từ đó cho thấy, vacxin tái tổ hợp MBP-VT2eB ở liều tiêm là 50μg và 75μg/heo trong keo phèn là an toàn đối với heo con.
4.2 ĐỊNH TÍNH KHÁNG HUYẾT THANH THEO PHƢƠNG PHÁP KẾT TỦA KHUYẾCH TÁN TRÊN THẠCH
Phƣơng pháp kết tủa khuyếch tán trên thạch cho phép xác định sự hiện diện của kháng thể dựa trên nguyên tắc kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên kháng thể. Phƣơng pháp này có ƣu điểm là đơn giản và nhanh chóng. Chúng tôi đã tiến hành định tính kháng huyết thanh thu đƣợc theo phƣơng pháp kết tủa khuyếch tán trên thạch nhằm đánh giá sơ bộ hiệu quả gây đáp ứng miễn dịch của protein tái tổ hợp.
4.3.1 Với kháng nguyên là độc tố của E. coli H28
Thực hiện định tính kháng huyết thanh bằng phƣơng pháp kết tủa khuyếch tán
trên thạch với kháng nguyên là độc tố của E.coli H28 đều cho kết quả âm tính với cả
mẫu huyết thanh heo và đối chứng dƣơng. Đối chứng dƣơng là huyết thanh thỏ đã cho kết quả dƣơng tính trên môi trƣờng nuôi cấy tế bào. Phƣơng pháp khuyếch tán
28
kết tủa khuyếch tán trên thạch là một phƣơng pháp kém nhạy, do đó kết quả âm tính có thể do những nguyên nhân sau đây:
Hàm lƣợng kháng thể trong kháng huyết thanh quá thấp hay không có nên không có phản ứng kết tủa xảy ra.