Các mẫu lá khoai tây có triệu chứng bị nhiễm bệnh đƣợc thu từ một số vùng thuộc miền Bắc Việt Nam. Các mẫu nghiên cứu đƣợc thể hiện trong bảng sau:
Bảng 2.1. Danh sách các mẫu thu tại các điểm nghiên cứu
STT Địa điểm thu thập mẫu Kí hiệu
1 Phú Bình – Thái Nguyên Phú Bình
2 Phổ Yên – Thái Nguyên Phổ Yên
3 Văn Lâm – Hƣng Yên Hƣng Yên
4 Việt Yên - Bắc Giang Bắc Giang
5 Thái Thụy - Thái Bình Thái Bình
2.2. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 2.2.1. Hoá chất
- Bộ kit tách chiết RNA tổng số của hãng Invitrogen. - Bộ kit tổng hợp cDNA của hãng Fermentas.
- Bộ hoá chất sử dụng cho kĩ thuật PCR. - Bộ kit tinh sạch sản phẩm PCR của Bioneer.
- Các hoá chất thông dụng phục vụ cho các kĩ thuật sinh học phân tử nhƣ agarose, cồn, X- gal, ampicilin…
2.2.2. Thiết bị
Máy li tâm, máy soi gel, bộ điện di, tủ cấy vô trùng, máy chụp ảnh, pipet, máy PCR, máy xác định trình tự nucleotit tự động và nhiều thiết bị khác.
2.2.3. Địa điểm nghiên cứu
Các thí nghiệm đƣợc tiến hành tại:
+ Phòng thí nghiệm Di truyền học, khoa Sinh-trƣờng Đại học Sƣ phạm; Phòng thí nghiệm thuộc khoa Sinh-trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên.
+ Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Các thí nghiệm công bố trong luận văn đƣợc thể hiện qua sơ đồ sau:
Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát
2.3.1. Phƣơng pháp thống kê
Tỉ lệ khoai tây có triệu chứng nhiễm PVY đƣợc xác định theo phƣơng pháp thống kê. Trong mỗi khu vực nghiên cứu, lấy ngẫu nhiên 3 lô thí nghiệm. Mỗi lô có 100 khóm. Xác định số khóm có triệu chứng bị bệnh trong
Xác định tỉ lệ nhiễm, Thu thập mẫu bệnh Tách RNA tổng số Nhân gen CP Tách dòng gen Xác định và so sánh trình tự gen CP Khai thác trình tự trong NCBI
từng lô. Tỉ lệ khoai tây có triệu chứng bị bệnh ở mỗi vùng sẽ đƣợc tính bằng trung bình của tỉ lệ khoai tây có triệu chứng nhiễm bệnh trên 3 lô.
2.3.2. Phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số
Chúng tôi đã sử dụng bộ kit Trizol Reagents (Invitrogen) để tách chiết RNA tổng số theo quy trình sau:
- Cân 100mg lá khoai tây có triệu chứng nhiễm bệnh, nghiền nhanh trong nitơ lỏng, đảm bảo mẫu phải đƣợc nghiền triệt để và tránh enzyme RNase cắt RNA.
- Chuyển ngay mẫu vào ống eppendorf 2ml.
- Bổ sung 1ml Trizol Reagents, đảo đều ở nhiệt độ phòng (15-300C) trong 5 phút.
- Bổ sung 200µl Chloroform: Isoamyl (24:1). - Đảo đều ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. - Ly tâm 10000 vòng/phút trong 15 phút.
- Hút 500 dịch nổi, chuyển sang ống eppendorf 1,5ml.
- Bổ sung 500µl Isopropanol đã đƣợc làm lạnh đến 40C, lắc nhẹ ống để RNA kết tủa.
- Để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, ly tâm 10000 vòng/ phút trong 15 phút.
- Loại bỏ dịch nổi, rửa tủa RNA bằng cồn 700 pha trong DEPC 0,01%. - Ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút.
- Làm khô RNA bằng máy Speed Vac trong khoảng 3 phút. - Pha loãng RNA trong 40µl H2O đã xử lí DEPC 0,01%. - Ủ ở nhiệt độ 550C trong 5 phút để RNA tan hết.
Do RNA dễ bị RNase cắt nên tất cả các dụng cụ đều phải xử lí DEPC 1% và khử trùng trƣớc khi sử dụng.
2.3.3. Phƣơng pháp RT-PCR
Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction) là sự kết hợp của hai phản ứng: sao mã ngƣợc (reverse transcription) tạo cDNA và PCR để nhân một đoạn gen quan tâm từ cDNA.
Kỹ thuật RT-PCR để nhân gen CP đƣợc tiến hành theo hai bƣớc sau:
Bước 1: Tổng hợp cDNA
- Bổ sung lần lƣợt các thành phần sau đây vào ống eppendorf 0,5ml đã đƣợc xử lí DEPC 1% hoặc Rnase:
Thành phần Thể tích
250ng mồi ngẫu nhiên 2µl
10pg - 5µg RNA tổng số 2µl
dNTPs 10mM 2µl
- Bổ sung nƣớc DEPC 0,01% tới thể tích 13µl. - Ủ ở 650C trong 5 phút, sau đó đặt vào đá.
- Tiếp tục bổ sung các thành phần sau vào ống phản ứng:
Buffer 5X 4µl
DTT 0,1M 1µl
Rnase OUTTM (40 đơn vị/µl) 1µl
Cloned AMV RT (15 đơn vị/µl) 1µl
- Trộn mẫu nhẹ nhàng, sau đó thực hiện một chu kì nhiệt nhƣ sau:
Bƣớc Nhiệt độ (0 C) Thời gian (phút) 1 25 10 2 45 50 3 85 5 4 4 ∞
Bước 2: Phản ứng PCR
Sau khi tổng hợp cDNA, tiến hành chạy PCR với cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại gen CP. Thành phần, chu kì nhiệt cho phản ứng PCR đƣợc trình bày trong bảng 2.2 và bảng 2.3. Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nƣớc cất khử ion, khử trùng 12,5 2 Dung dịch đệm 10X 2,5 3 MgCl2 (25mM) 2,5 4 dNTPs (10mM) 2 5 Mồi xuôi 1 6 Mồi ngƣợc 1
7 Taq polymerase (1U/1µl) 0,5
8 cDNA 3
Tổng 25
Bảng 2.3. Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR
Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (0
C) Thời gian Chu kì
1 Biến tính 94 3 phút 1
2 Biến tính 94 1 phút
30
3 Gắn mồi 52 50 giây
4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút 30 giây
5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1
Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarase 1%, rồi đƣợc làm sạch (thôi gel) theo bộ kit của Bioneer và gắn vào vector pBT, sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α.
2.3.4. Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm PCR
- Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% và cắt lấy băng quan tâm, có kích thƣớc khoảng 1200bp.
- Bổ sung dung dịch QG theo tỉ lệ: Vmẫu:VQG= 1 : 3.
- Ủ ở 500C trong 15 phút, 3 phút trộn nhẹ một lần, sau khi gel tan hết ủ thêm 5 phút cho gel tan hoàn toàn.
- Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột thôi gel Qiaquick spin column, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ cột chảy qua cột.
- Thêm 750µl dung dịch PE vào cột, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. - Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột, ly tâm bổ sung 1 phút để loại hết PE.
- Hoà tan DNA trong 30-50µl H2O deion, khử trùng đã đƣợc làm ấm đến 500C để ở nhiệt độ phòng 1 phút sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút.
2.3.5. Phƣơng pháp gắn gen vào vector tách dòng
Thành phần phản ứng gắn gen vào vector đƣợc thể hiện ở trong bảng 2.4. Bảng 2.4. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng
STT Thành phần Thể tích (µl) 1 DNA 13 2 Ligation buffer 10X 2 3 pBT 2 4 PEG 4000 2 5 T4 ligase 1 Tổng 20
Hỗn hợp đƣợc ủ ở 220C trong 2 giờ, sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli.
2.3.6. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α
Bổ sung 20µl vector đã gắn gen vào ống dựng tế bào khả biến và trộn nhẹ. Hỗn hợp đƣợc ủ 40C trong 30 phút, rồi ủ ở 420
C chính xác 1 phút và sau đó ủ 40C trong đá 5 phút. Bổ sung 300µl môi trƣờng LB lỏng, hỗn hợp đƣợc nuôi ở 370C, lắc 200 vòng/phút trong 1 giờ. Sử dụng que cấy trải, trải 150- 250µl dịch khuẩn lên đĩa môi trƣờng LB đặc có chứa 100mg/l ampicillin, X- gal 0,004‰, IPTG 100µM. Ủ đĩa ở 370C trong 16 giờ.
2.3.7. Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR)
Kết quả của quá trình biến nạp là tổ hợp của các khuẩn lạc xanh và trắng. Chọn 10 khuẩn lạc trắng của mỗi mẫu để tiến hành phản ứng colony- PCR với cặp mồi pUC18 để xác định khuẩn lạc có plasmid mang đoạn gen CP mong muốn. Thành phần của phản ứng colony-PCR tƣơng tự nhƣ trong phản ứng PCR chỉ khác cặp mồi sử dụng và mẫu DNA thay bằng khuẩn lạc, nhiệt độ gắn mồi 540C. Điện di sản phẩm colony-PCR trên gel agarose 1% để chọn ra các khuẩn lạc chứa plasmid nhƣ mong muốn. Đồng thời, nuôi những khuẩn lạc này trong 3ml LB lỏng có bổ sung ampicillin 100mg/l để tách plasmid.
2.3.8. Tách chiết plasmid
Plasmid đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp TELT.
Quy trình:
- Lấy 2ml dịch khuẩn đã nuôi qua đêm cho vào ống eppendorf 2ml, ly tâm 10000 vòng/phút trong 7 phút, loại dịch.
- Bổ sung 200µl TELT, 10µl lyzozim, khuấy tan để khuẩn tan hết. - Để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, ủ ở 950C trong 3 phút, ủ 40
C trong 5 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút.
- Hút dịch nổi sang ống eppendorf 1,5ml, bổ sung một lƣợng tƣơng đƣơng isopropanol, ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút.
- Loại dịch nổi, rửa tủa 2 lần bằng cồn 700. - Làm khô plasmid bằng máy Speed Vac.
- Hoà tan plasmid trong 40µl nƣớc cất khử ion, khử trùng. - Bổ sung 0,1µl Rnase, ủ ở 370C trong 2 giờ.
- Tinh sạch plasmid để đọc trình tự.
Quy trình tinh sạch plasmid:
- Bổ sung PB theo tỉ lệ Vmẫu:VPB=1:5, mix nhẹ.
- Cho hỗn hợp dung dịch vào cột tinh sạch, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút.
- Bổ sung 0,75ml dung dịch NW, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. - Loại dịch, ly tâm bổ sung 1 phút để loại sạch NW. Cho cột tinh sạch vào ống eppendorf 1,5ml.
- Bổ sung 30µl H2O deion khử trùng, để ở nhiệt độ phòng 1-2 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút.
2.3.9. Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide
Trình tự gen CP đƣợc xác định trên máy đọc tự động ABI PRISM®
3100 Avant Genetic Analyzer theo bộ kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing. Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR đọc trình tự trên máy luân nhiệt GeneAmp®
PCR System 9700 nhƣ sau: Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR đọc trình tự STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Dung dịch đệm (5X) 3 2 Mồi 1,275 3 DNA mẫu (~200ng) 7,725 4 BigDye 3 Tổng 15
Bảng 2.6. Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR đọc trình tự
Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (0
C) Thời gian Chu kì
1 Biến tính 96 1 phút 1
2 Biến tính 96 10 giây
25
3 Gắn mồi 55 5 giây
4 Kéo dài chuỗi 60 4 phút
5 Hoàn tất kéo dài 72 8 phút 1
6 Kết thúc phản ứng 4 30 phút
Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng cách bổ sung 5µl EDTA 125mM, 60µl cồn 100% và ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Tiếp đó ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút để tủa các đoạn DNA, sau đó loại bỏ cồn. Bổ sung 60µl cồn 70% và li tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút. Làm khô kết tủa DNA, bổ sung 10µl Hi-DiTM
Formamide và biến tính ở 950C trong 5 phút. Các mẫu đƣợc tra vào các giếng của khay đựng mẫu, sau đó điện di trong ống mao quản với polymer PoP-4TM
của hãng ABI, Mỹ. Kết quả đƣợc xử lí bằng phần mềm DNAstar.
2.3.10. Phƣơng pháp xử lí trình tự gen thu đƣợc
Hiện nay, có nhiều phần mềm chuyên dụng xử lí trình tự gen nhƣ PC GENE, Clustal, DNAstar, BioEdit, Chromas…. Trong các phần mềm kể trên, DNAstar là hệ thống phần mềm tiện dụng nhất, đƣợc tạo ra bởi một nhóm các nhà khoa học Mỹ. Phần mềm này bao gồm nhiều chƣơng trình với các chức năng khác nhau dùng để phân tích và xử lí số liệu trong sinh học phân tử.
Việc so sánh và xử lí trình tự gen CP đƣợc tiến hành theo trình tự sau: - So sánh trình tự gen đƣợc đọc từ hai đầu xuôi và ngƣợc để xác định trình tự đầy đủ và đúng của gen.
- So sánh trình tự đầy đủ của gen với các trình tự gen trong BLAST của NCBI để xác định gen đƣợc tách dòng là của PVY.
- Giải mã trình tự nucleotide sang trình tự acid amine theo một trong các khung đọc mở, xác định vị trí mở đầu và kết thúc dịch mã.
- Lập cây phân loại và bảng hệ số đồng dạng so sánh mức độ tƣơng đồng di truyền của 3 trình tự nucleotide của 3 dòng gen CP thu đƣợc với nhau và với trình tự gen CP của các PVY từ nhiều khu vực khác nhau trên thế giới đã đƣợc công bố trong ngân hàng dữ liệu gen (Gen Bank).
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT TỈ LỆ NHIỄM PVY Ở MỘT SỐ ĐỊA PHƢƠNG
Chúng tôi đã tiến hành điều tra các vùng trồng khoai tây ở một số tỉnh miền bắc Việt Nam và tiến hành khảo sát ở các địa điểm sau:
+ Cánh đồng khoai tây thuộc thôn Hành Lạc, thị trấn Nhƣ Quỳnh, huyện Văn Lâm, tỉnh Hƣng Yên.
+ Cánh đồng khoai tây thuộc làng Khả Lý Hạ, xã Quảng Minh, huyện Việt Yên, tỉnh Bắc Giang.
+ Cánh đồng khoai tây tại thôn Thùa Lâm, xã Tiên Phong, huyện Phổ Yên, tỉnh Thái Nguyên.
+ Cánh đồng khoai tây thuộc huyện Phú Bình, tỉnh Thái Nguyên. + Cánh đồng khoai tây thuộc xã Thụy Ninh, huyện Thái Thụy, tỉnh Thái Bình. Trong đó, chỉ cánh đồng ở Phổ Yên-Thái Nguyên trồng khoai tây Hà Lan còn các cánh đồng khác trồng khoai tây Trung Quốc. Thời điểm khảo sát là khi khoai tây đã trồng đƣợc 1 tháng rƣỡi đến 2 tháng.
Ở mỗi vùng, chúng tôi đã tiến hành phát hiện và xác định tỉ lệ khoai tây có triệu chứng nhiễm PVY. Việc chẩn đoán cây bị bệnh đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp quan sát bằng mắt thƣờng. Trên từng cánh đồng, chúng tôi lấy 3 lô ngẫu nhiên, mỗi lô 100 khóm. Xác định số khóm có triệu chứng nhiễm PVY trên từng lô. Tỉ lệ khoai tây có triệu chứng nhiễm PVY trên mỗi cánh đồng đƣợc tính bằng giá trị trung bình tỉ lệ nhiễm ở 3 lô. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Bảng 3.1. Tỉ lệ có triệu chứng bị bệnh ở các cánh đồng khoai tây nghiên cứu
Cánh đồng khoai tây Ký hiệu Triệu chứng nhiễm PVY (%)
Phổ Yên-Thái Nguyên Phổ Yên 14,23 ± 2,56
Phú Bình-Thái Nguyên Phú Bình 28,07 ± 3,03
Thái Thụy-Thái Bình Thái Bình 20,03 ± 3,13
Văn Lâm-Hƣng Yên Hƣng Yên 22,56 ± 2,85
Việt Yên-Bắc Giang Bắc Giang 31,71 ± 2,15
Nhƣ vậy, tỷ lệ khoai tây có triệu chứng nhiễm PVY dao động từ 14,23±2,56% đến 31,71±2,15%. Kết quả này phù hợp với kết quả điều tra của Trƣơng Văn Hộ và cs (1990) [4]. Trong đó, cánh đồng ở Bắc Giang có tỷ lệ khoai tây mang triệu chứng nhiễm PVY cao nhất (31,71±2,85%) và ở Phổ Yên-Thái Nguyên có tỷ lệ khoai tây mang triệu chứng nhiễm PVY thấp nhất (14,23±2,56%).
Cánh đồng khoai tây khảo sát ở Bắc Giang Mẫu có triệu chứng nhiễm bệnh ở Bắc Giang
Cánh đồng khoai tây khảo sát ở Hưng Yên Mẫu có triệu chứng bị bệnh ở Hưng Yên
Tuy vậy, phƣơng pháp chuẩn đoán bằng mắt thƣờng dễ có sự nhầm lẫn với các bệnh khác nhƣ bệnh do tuyến trùng, các bệnh sinh lí do dinh dƣỡng hay điều kiện khí hậu gây ra. Ngoài ra, dễ nhầm lẫn virus này với những virus khác do có sự xâm nhiễm hỗn hợp của các virus trên cùng một cây. Do đó, chuẩn đoán chính xác khoai tây nhiễm PVY cần kết hợp với các phƣơng pháp khác nhƣ sử dụng kính hiển vi điện tử, phƣơng pháp huyết thanh hay sinh học phân tử.
Trong nghiên cứu này, để xác định các mẫu lá khoai tây có triệu chứng nhiễm PVY thu đƣợc từ 5 cánh đồng khoai tây trên có chính xác là bị nhiễm PVY hay không, chúng tôi tiến hành phân lập và xác định trình tự gen CP của PVY.
3.2. KẾT QUẢ NHÂN GEN, TÁCH DÒNG cDNA3.2.1. Kết quả nhân gen bằng kỹ thuật RT-PCR 3.2.1. Kết quả nhân gen bằng kỹ thuật RT-PCR
Chúng tôi đã thu thập một số mẫu lá khoai tây có triệu chứng nhiễm PVY từ 5 cánh đồng khoai tây: Phổ Yên, Phú Bình, Thái Bình, Hƣng Yên, Bắc Giang. Sau đó, tiến hành phân lập gen CP của PVY từ các mẫu lá khoai tây này.
Trƣớc tiên, chúng tôi tiến hành tách chiết RNA tổng số từ mẫu lá có