Kỹ thuật RAPD là kỹ thuật phân tích sự đa hình các phân đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên, do hai nhóm nghiên cứu của Williams và CS (1990) [52] và Welsh và McClelland (1991) đồng thời xây dựng [51]. Đây là một kỹ thuật phát hiện chỉ thị di truyền dựa trên phản ứng chuỗi polymerase (PCR) [27]. PCR là một công cụ hữu hiệu cho việc phân tích hệ gen thực vật, vì nó có khả năng tạo ra một lượng lớn các trình tự DNA đặc hiệu từ bất kỳ cơ thể nào. Hiện nay PCR được xem là phương pháp nhanh, chính xác, tương đối đơn giản để đánh giá sinh vật chuyển gen, phân tích nhanh chóng sự biến dị di truyền ở phạm vi quần thể và giữa các cá thể.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
18
Sự hạn chế lớn nhất của kỹ thuật này là phải dựa trên một trình tự DNA đặc hiệu. Tuy nhiên, hạn chế này đã được các nhà sinh học phân tử cải tiến, khắc phục đó là kỹ thuật PCR sử dụng đoạn mồi ngẫu nhiên hay còn gọi là kỹ thuật RAPD [34].
Các thành phần cần thiết để tiến hành phản ứng RAPD bao gồm: - DNA khuôn (DNA template) với nồng độ 5 - 50 ng trong 25µl.
- Đoạn mồi (primer): Chỉ sử dụng một mồi đó là một oligonucleotide có trật tự nucleotide ngẫu nhiên và có chiều dài khoảng 10 nucleotide. - DNA polymerase: Hoạt động của DNA-polymerase phụ thuộc vào
Mg2+, nồng độ dNTP, pH, nhiệt độ biến tính DNA. DNA-polymerase thường dùng là Taq-polymerase.
- Bốn loại deoxyribonucleotide triphotphat (dNTP). - Ion Mg2+ và dung dịch đệm.
Phản ứng RAPD được tiến hành qua các giai đoạn giống như PCR: - Giai đoạn biến tính DNA: Ở nhiệt độ 950
C trong 30 - 60 giây làm cho hai mạch khuôn tách nhau.
- Giai đoạn tiếp mồi: Khi hạ nhiệt độ xuống 32 - 400 C, mồi tiếp hợp và bám vào sợi DNA khuôn.
- Giai đoạn tổng hợp: Nhiệt độ được nâng lên 720 C thì các đoạn mồi đã bắt cặp với các mạch đơn sẽ được kéo dài với sự tham gia của Taq- polymerase.
Sau một chu kỳ gồm ba giai đoạn như trên, một phân đoạn DNA khuôn
được nhân lên thành hai, các đoạn DNA được nhân bản trong mỗi chu kỳ lại được coi là DNA khuôn cho mỗi chu kỳ nhân bản tiếp theo. Vậy sau k chu kỳ nhân bản sẽ tạo ra 2k
các đoạn DNA giống đoạn DNA khuôn ban đầu. RAPD có thể thực hiện từ 40 - 45 chu kỳ.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
19
Kỹ thuật RAPD có ưu điểm ở chỗ sử dụng các mồi ngẫu nhiên dài 10 nucleotide, quá trình nhân bản DNA là ngẫu nhiên. Đoạn mồi này có thể bám vào bất kỳ vị trí nào có trình tự nucleotide bổ sung trên phân tử DNA hệ gen. Với đặc điểm là ngắn nên xác suất đoạn mồi có được điểm gắn trên phân tử DNA khuôn là rất lớn. Tùy vào nhóm, loài thực vật hay vi sinh vật mà các đoạn mồi ngẫu nhiên được thiết kế chuyên dụng. Theo lý thuyết, số lượng các đoạn DNA được nhân bản phụ thuộc vào độ dài, vị trí của các đoạn mồi, kích thước và cấu trúc DNA genome. Thông thường mỗi đoạn mồi ngẫu nhiên sẽ tạo ra từ 2 - 10 sản phẩm nhân bản. Kết quả là sau khi điện di sản phẩm RAPD sẽ phát hiện được sự khác nhau trong phổ các phân đoạn DNA được nhân bản. Sự khác nhau đó gọi là tính đa hình. Hiện tượng đa hình các đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên xuất hiện là do có sự biến đổi trình tự nucleotide tại vị trí các đoạn mồi liên kết. Sản phẩm khuếch đại được phân tích bằng điện di trên gel agarose hoặc polyacrylamide và có thể quan sát được sau khi gel được nhuộm bằng hoá chất đặc trưng. Vì vậy, tính đa hình thường được nhận ra do sự có mặt hay vắng mặt của một sản phẩm nhân bản [49].
Trong những năm gần đây, kỹ thuật RAPD được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy, RAPD là một phương pháp có hiệu quả trong việc xác định kiểu gen, phân tích quần thể và nguồn gốc loài, nghiên cứu di truyền và lập bản đồ di truyền [3]. Phương pháp này còn được ứng dụng trong việc đánh giá bộ gen của giống và khả năng phân tích.
Kỹ thuật RAPD còn dùng để nhận biết, phân loại các giống cây trồng khác nhau như chuối, lúa mì, đu đủ, đậu tương...và phát hiện, bảo tồn sự đa dạng di truyền đặc biệt là các loài quí hiếm hay một số giống thực vật địa phương.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
20