3.3 TINH SẠCH ENDOGLUCANASE
3.3.2 Tinh sạch qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE
80 120 0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 H oạt tí nh endo glu canas e tươ ng đối (% )
Thời gian nuơi cấy (giờ)
Hình 3.4. Khả năng sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian của chủng A. awamori VTCC-F-099
Kết quả nghiên cứu của chúng tơi cũng phù hợp với một số kết quả nghiên cứu trong nƣớc cũng nhƣ trên thế giới. Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả trƣớc đây cho thấy, các chủng thuộc Trichoderma harzianam, Trichoderma spp, Phanerochaete chrysosporium và A. niger sinh tổng hợp endoglucanase cao nhất sau 96 giờ nuơi cấy với hoạt tính enzyme tƣơng ứng là 1,88; 1,53; 2,40 và 0,096 IU/ml [18], [41]. Các chủng nấm sợi phân lập từ rác thải sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất sau 144 giờ nuơi cấy [8], cịn ba chủng nấm sợi thuộc các lồi Penicillium pinophinum, P. persicinum,
P. brasilianum cĩ khả năng sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất sau 110-140 giờ nuơi cấy với hoạt tính khoảng 0,4 IU/ml [33], chủng Penicillium sp. DTQ-HK1 sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất sau 120 giờ nuơi cấy [10]. Tăng Thị Chính và cs (1999) khi nghiên cứu một số chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải cho thấy, các chủng vi khuẩn
Số hĩa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
47
sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất sau 48 giờ nuơi cấy, cịn các chủng xạ khuẩn sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất sau 48-72 giờ nuơi cấy [5]. Nhƣ vậy, các chủng nấm sợi thƣờng sinh tổng hợp endoglucanase chậm hơn so với các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn.
4.2.2 Nhiệt độ nuơi cấy
Chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợc nuơi cấy trong mơi trƣờng MT1, lắc 200 vịng/phút trong 96 giờ, ở các nhiệt độ khác nhau: 25, 28, 30, 32 và 37C để đánh giá ảnh hƣởng của nhiệt độ mơi trƣờng nuơi cấy lên khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng nấm này và tìm ra nhiệt độ nuơi cấy tối ƣu. Kết quả trên hình 3.5 cho thấy, hoạt tính endoglucanase tăng dần trong dải nhiệt độ 25C-30C, nhiệt độ tối ƣu cho khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng nấm nghiên cứu là 30C, hoạt tính đạt 0,56 IU/ml. Ở các nhiệt độ cao hơn, hoạt tính endoglucanase lại giảm dần, ở 37C chỉ cịn 0,44 IU/ml, đạt 78% so với hoạt tính cực đại (Hình 3.5, Bảng 3.4).
Khi nghiên cứu trên các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải, Tăng Thị Chính và cs (1999) thấy rằng, các chủng này sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất ở điều kiện nhiệt độ 45-55C và cĩ thể chịu đƣợc nhiệt độ 65-80C [5]. Nghiên cứu của Nguyễn Lan Hƣơng và cs (1999) cũng cho thấy, các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn ƣa nhiệt sinh tổng hợp cellulase cao nhất ở nhiệt độ 50C [9]. Chủng xạ khuẩn thuộc Actinomyces griseus cĩ khả năng sinh tổng hợp cellulase tối ƣu ở nhiệt độ 58C [13]. Theo Acharya và cs (2008), các chủng A. niger sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất khi lên men trong điều kiện 28C, pH 4,0-4,5 [18]. Kết quả nghiên cứu của Trịnh Đình Khá (2006) trên chủng Penicillium sp. DTQ-HK1 cho thấy, chủng này sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất khi nuơi cấy trong điều kiện 30C [10]. Nhƣ vậy, chủng A. awamori VTCC-F-099 là một chủng ƣa ấm và
Số hĩa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
48
trong các nhiệt độ khảo sát, nhiệt độ tối ƣu cho khả năng sinh tổng hợp endoglucanase là 30C. 0 40 80 120 20 25 30 35 40 H oạt tí nh endogluc anas e tươ ng đối (%)
Nhiệt độ nuơi cấy (oC)
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuơi cấy đến khả năng sinh tổng hợp
endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099
4.2.3 Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất cảm ứng
Cơ chất với một nồng độ nhất định thƣờng đĩng vai trị là chất cảm ứng cho quá trình sinh tổng hợp một loại enzyme tƣơng ứng. Để xác định khả năng cảm ứng của cơ chất CMC đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase, chủng nấm nghiên cứu đƣợc nuơi cấy trong mơi trƣờng cơ bản cho sinh tổng hợp endoglucanase, CMC đƣợc bổ sung với các nồng độ khác nhau: từ 0,2-4%, sau 96 giờ thu dịch canh trƣờng và xác định hoạt tính endoglucanase. Kết quả cho thấy, khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 thay đổi rõ rệt khi nồng độ CMC trong mơi trƣờng thay đổi. Hoạt tính endoglucanase tăng dần trong dải nồng độ
Số hĩa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
49
từ 0-2% CMC, đạt cực đại tại nồng độ 2% (0,81 IU/ml). Sau đĩ, khi nồng độ CMC tiếp tục tăng vƣợt quá 2% thì hoạt tính endoglucanase lại giảm dần. Ở nồng độ 3% CMC thì hoạt tính endoglucanase cịn khoảng 61% (0,49 IU/ml) và ở nồng độ 4% hoạt tính chỉ cịn 0,42 IU/ml, đạt khoảng 52% so với hoạt tính khi đạt cao nhất (Hình 3.6, Bảng 3.5). Nhƣ vậy, CMC với nồng độ 2% cĩ vai trị cảm ứng tốt nhất khả năng sinh tổng hợp endoglucanase ngoại bào của chủng A. awamori VTCC-F-099.
0 40 80 120 0 1 2 3 4 5 H oạt tí nh endogluc anas e tươ ng đối (%) Nồng độ CMC (%)
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ CMC đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099
Khi nghiên cứu chủng Penicillium sp. DTQ-HK1, Trịnh Đình Khá (2006) thấy rằng, chủng này sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất khi 0,5% CMC đƣợc bổ sung vào mơi trƣờng nuơi cấy [10].
Số hĩa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
50
4.2.4 Ảnh hƣởng của nguồn carbon và nồng độ nguồn carbon
Chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợc nuơi cấy trong mơi trƣờng MT1 chứa 2% CMC, cao nấm men đƣợc thay thế bằng một số nguồn carbon khác, ở 30C, lắc 200 vịng/phút, sau 96 giờ. Kết quả cho thấy, khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng nấm nghiên cứu khi sử dụng các nguồn carbon khác nhau cĩ sự sai khác đáng kể. Trong đĩ, hoạt tính enzyme này cao nhất khi lõi ngơ đƣợc sử dụng làm nguồn carbon thay cho cao nấm men (0,87 IU/ml), tiếp theo là bã mía (0,75 IU/ml) và glucose (0,70 IU/ml) (Bảng 3.6). Nhƣ vậy, với mục đích tìm nguồn nguyên liệu sắn cĩ, nhất là nguồn phế phụ phẩm nơng nghiệp thì lõi ngơ đƣợc xem là nguồn carbon thay thế thích hợp cho chủng A. awamori VTCC-F-099 sinh tổng hợp endoglucanase.
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của nguồn carbon
Nguồn carbon Hoạt tính endoglucanase IU/ml % Bã mía 0,75 ± 0,146 86 Cao nấm men 0,65 ± 0,166 74 Glucose 0,70 ± 0,134 80 Lactose 0,28 ± 0,084 32 Lõi ngơ 0,87 ± 0,158 100 Mùn cƣa 0,39 ± 0,101 45 Xơ dừa 0,54 ± 0,129 62 Sucrose 0,60 ± 0,019 69 Vỏ cà phê 0,64 ± 0,127 74 Vỏ cám trấu 0,57 ± 0,052 65 Vỏ lạc 0,51 ± 0,026 59 Vỏ quýt 0,65 ± 0,166 74
Số hĩa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
51
Theo một số nghiên cứu trƣớc đây, các chủng nấm mốc sinh tổng hợp các enzyme thuộc nhĩm cellulase mạnh trong những mơi trƣờng cĩ nguồn carbon tự nhiên nhƣ mùn cƣa, bã mía, lõi ngơ [18], [50]. Ở một số chủng Penicillium cĩ khả năng sinh tổng hợp endoglucanase và -glucosidase mạnh trong mơi trƣờng cĩ nguồn cơ chất cellulose tự nhiên cịn đối với nguồn cơ chất là xylan yến mạch và birchwood xylan thì hoạt tính rất thấp [33].Chủng Penicillium sp. DTQ-HK1 sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất khi 0,6% rơm đƣợc sử dụng nhƣ một nguồn carbon [10].
Sau khi tìm đƣợc nguồn carbon thay thế thích hợp là lõi ngơ, chúng tơi tiến hành tối ƣu nồng độ nguồn carbon thay thế trên. Kết quả nghiên cứu cho thấy, hoạt tính endoglucanase cĩ sự thay đổi đáng kể khi thay đổi nồng độ lõi ngơ trong mơi trƣờng nuơi cấy. Trong dải nồng độ khảo sát (0,5-5%) thì nồng độ lõi ngơ thích hợp nhất cho khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng nấm nghiên cứu là 3%, hoạt tính đạt 0,90 IU/ml (Hình 3.7, Bảng 3.7).
0 40 80 120 0 1 2 3 4 5 H oạt tí nh endogluc anas e tươ ng đối (%) Nồng độ lõi ngơ (%)
Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nồng độ lõi ngơ đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099
Số hĩa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
52
Theo nghiên cứu của một số tác giả thì lõi ngơ khơng chỉ thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp các enzyme thuộc nhĩm cellulase mà cịn là nguồn cơ chất cảm ứng cho một số lồi vi sinh vật sinh tổng hợp một số enzyme khác nhƣ xylanase [16], [17].
4.2.5 Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen và nồng độ nguồn nitrogen
Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của các nguồn nitrogen trong mơi trƣờng nuơi cấy lên khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng
A. awamori VTCC-F-099 cho thấy, khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng nấm nghiên cứu khi nuơi trong mơi trƣờng cĩ chứa các nguồn nitrogen khác nhau cĩ sự khác nhau đáng kể. Trong số các nguồn nitrogen đƣợc khảo sát thì ammonium acetate đƣợc xem là nguồn nitrogen thích hợp nhất cho chủng A. awamori VTCC-F-099 sinh tổng hợp endoglucanase (4,88 IU/ml) (Bảng 3.8). Đây là một nguyên liệu khá dễ kiếm nên đƣợc chọn là nguồn nitrogen để thay thế cho các nguồn nitrogen cĩ trong mơi trƣờng cơ bản MT1.
Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen
Nguồn nitrogen Hoạt tính endoglucanase
IU/ml % Ammonium acetate 4,88 ± 0,129 100 Ammonium nitrate 3,91 ± 0,104 80 Ammonium sulphate 4,19 ± 0,124 86 Bột cá 4,10 ± 0,118 84 Bột đậu tƣơng 3,51 ± 0,115 72 Casein 3,44 ± 0,128 71 Peptone 3,67 ± 0,105 75 Urea 3,87 ± 0,077 79
Nghiên cứu của Tăng Thị Chính và cs (1999) cũng cho thấy, các nguồn nitrogen hữu cơ (peptone, cao nấm men và bột đậu tƣơng) thích hợp cho
Số hĩa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
53
quá trình sinh trƣởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi khuẩn chịu nhiệt [5]. Bột đậu tƣơng cũng là nguồn nitrogen ảnh hƣởng mạnh tới khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng A. niger RNNL-363 [11]. Nghiên cứu của Trịnh Đình Khá (2006) cho thấy, chủng Penicillium sp. DTQ-HK1 sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất khi 1,6% bột đậu tƣơng đƣợc sử dụng nhƣ nguồn nitrogen trong quá trình lên men [10].
Sau khi tìm đƣợc nguồn nitrogen thay thế thích hợp là ammonium acetate, chúng tơi tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ nguồn nitrogen này đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng nấm nghiên cứu. 0 40 80 120 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 H oạt tí nh endo gluc anas e tươ ng đối (%) Nồng độ ammonium acetate (%)
Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ ammonium acetate đến khả năng sinh
tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099
Kết quả nghiên cứu cho thấy, hoạt tính endoglucanase của chủng nấm nghiên cứu cĩ sự thay đổi đáng kể khi thay đổi lƣợng amonium acetate trong thành phần mơi trƣờng. Hoạt tính enzyme tăng nhẹ trong dải nồng độ
Số hĩa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
54
0,1-0,25%, sau đĩ tiếp tục tăng mạnh và đạt cực đại tại 0,3% amonium acetate (4,97 IU/ml). Tiếp theo, khi nồng độ amonium acetate tiếp tục tăng vƣợt quá 0,3% thì hoạt tính endoglucanase lại giảm dần. Ở nồng độ 0,35% ammonium acetate thì hoạt tính endoglucanase là 4,03 IU/ml, đạt 81% và ở nồng độ 0,5% ammonium acetate thì hoạt tính chỉ cịn 3,51 IU/ml, đạt 71% so với hoạt tính enzyme khi đạt cực đại (Hình 3.8, Bảng 3.9).
4.2.6 pH mơi trƣờng nuơi cấy ban đầu
pH mơi trƣờng nuơi cấy ban đầu là một trong những yếu tố cĩ ảnh hƣởng lớn đến tốc độ sinh trƣởng và khả năng sinh tổng hợp các enzyme của các lồi vi sinh vật. Chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợc nuơi cấy trong mơi trƣờng MT1 chứa 2% CMC, 3% lõi ngơ, 0,3% ammonium acetate đƣợc điều chỉnh pH từ 3,0 đến 8,0 bằng các dung dịch HCl/NaOH, lắc 200 vịng/phút, ở 30C, trong 96 giờ. Kết quả đƣợc thể hiện nhƣ hình 3.9 và bảng 3.10.
0 40 80 120 2 3 4 5 6 7 8 9 H oạt tí nh end oglu cana se tươ ng đối (%) pH
Hình 3.9. Ảnh hƣởng của pH mơi trƣờng nuơi cấy đến khả năng
Số hĩa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
55
Kết quả trên hình 3.9 và bảng 3.10 cho thấy, khả năng sinh tổng hợp endoglucanase tăng dần trong dải pH 3,0-6,5, đạt cực đại tại pH 6,5 (5,22 IU/ml). Sau đĩ, khi pH tiếp tục tăng vƣợt qua pH 6,5 thì hoạt tính enzyme bắt đầu giảm dần. Ở pH 7 hoạt tính là 4,84 IU/ml, đạt 93% và đến pH 8 thì hoạt tính enzyme chỉ là 4,57 IU/ml, đạt 88% so với hoạt tính cực đại. Nhƣ vậy, pH 6,5 là tối ƣu cho chủng A. awamori VTCC-F-099 sinh tổng hợp endoglucanase.
Nghiên cứu của Đặng Minh Hằng (1999) trên một số chủng nấm sợi cho thấy, khả năng sinh tổng hợp cellulase của chúng mạnh nhất trong khoảng pH 4,5-6,0 [8]. Các chủng A. niger sinh tổng hợp endoglucanase mạnh nhất trong khoảng pH mơi trƣờng ban đầu từ 6,0-7,0 [19]. Trong khi đĩ, các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt sinh tổng hợp cellulase thích hợp với pH mơi trƣờng ban đầu là 8,0 [5].
4.3 TINH SẠCH ENDOGLUCANASE
4.3.1 Tinh sạch qua cột sắc ký lọc gel sephadex G-100
Dịch enzyme sau khi đƣợc ly tâm 10000 vịng/phút trong 10 phút, đƣợc đƣa lên cột sắc ký lọc gel sephadex G-100 với tổng thể tích là 10 ml. Tốc độ dịng chảy là 25 ml/giờ. Thu 20 phân đoạn, thể tích mỗi phân đoạn 2 ml. Kết quả kiểm tra hoạt tính endoglucanase của các phân đoạn (Bảng 3.11) cho thấy, endoglucanase tập trung ở các phân đoạn từ 6 đến 16. Điện di đồ hình 3.10 cho thấy, ở các phân đoạn vẫn cịn khá nhiều băng protein, tuy nhiên xuất hiện một băng protein đậm cĩ khối lƣợng dƣới 35 kDa.
Số hĩa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
56
Hình 3.10. Điện di đồ trên gel polyacrylamide sản phẩm tinh sạch endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 qua cột Sephadex G-100 (1-5: các phân đoạn 7-11 qua cột sephadex G-100; 6: Marker; 7: dịch enzyme thơ)
4.3.2 Tinh sạch qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE
Những phân đoạn qua cột sephadex G-100 cĩ hoạt tính endoglucanase cao (phân đoạn 6-16) đƣợc đƣa tiếp lên cột sắc kí trao đổi ion DEAE với tổng thể tích 12 ml. Tốc độ dịng chảy là 20 ml/giờ. Thu 20 phân đoạn, thể tích mỗi phân đoạn 2 ml. Kết quả kiểm tra hoạt tính endoglucanase của các phân đoạn cho thấy, các phân đoạn từ 3 đến 7 cĩ hoạt tính riêng cao hơn hẳn so với các phân đoạn khác (Bảng 3.12). Các phân đoạn cĩ hoạt tính cao: từ phân đoạn 3 đến phân đoạn 7 đƣợc điện di kiểm tra trên gel 12,5% polyacrylamide. Điện di đồ hình 3.11 cho thấy, enzyme thu đƣợc ở các phân đoạn trên là khá sạch. Các phân đoạn trên đều cĩ duy nhất một loại protein cĩ khối lƣợng phân tử khoảng 32 kDa. Enzyme thu đƣợc cĩ độ sạch 3,08 lần so với dịch enzyme thơ ban đầu (Bảng 3.13).
kDa 166
66
45 35
Số hĩa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
57
Bảng 3.13. Tĩm tắt quá trình tinh sạch endoglucanase từ chủng
A. awamori VTCC-F-099 Bƣớc tinh sạch Protein tổng số (mg protein/ml) Hoạt tính endoglucamase Độ tinh sạch (lần) Hiệu suất thu hồi (%) IU/ml IU/mg protein
Dịch thơ 0,79 16,69 21,19 1 100
Sắc kí lọc gel
Sephadex G-100 0,28 6,30 22,44 1,06 76 Sắc ký trao đổi
ion DEAE 0,02 1,19 65,30 3,08 7
Hình 3.11. Điện di đồ sản phẩm tinh sạch endoglucanase trên gel polyacrylamide (1: dịch enzyme thơ; 2: marker; 3-7: các phân đoạn 3-7 qua cột DEAE).
4.4 NHỮNG TÍNH CHẤT LÝ HĨA CỦA ENDOGLUCANASE
4.4.1 Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất
Khi tăng nồng độ cơ chất thì vận tốc phản ứng tăng theo nghĩa là hoạt tính của enzyme tăng. Tuy nhiên, vận tốc phản ứng đạt cực đại ở một giới hạn nồng độ cơ chất nhất định, nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất, cĩ thể vận tốc phản ứng lại giảm xuống [4].