2.2.5.1. Lựa chọn môi trường lên men thích hợp
-33-
A - 4, A - 4H, A - 9, ISP - 4, Gause - I và Gause - II. Sau 96 giờ nuôi cấy trên máy lắc 220 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng. Xác định HTKS trong dịch lên men (phương pháp đục lỗ) và sinh khối (phương pháp khoanh giấy lọc) để chọn ra môi trường cơ bản phù hợp cho những nghiên cứu tiếp theo [34].
2.2.5.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Bổ sung nguồn cacbon (%): Tinh bột tan 1 và 2; glucoza - 1,5; lactoza - 1,5; sacaroza - 1,5; rỉ đường - 1,5; vào hỗn hợp dung dịch muối (dung dịch muối A) đã bổ sung 0,2 % (NH4)2SO4.
Bổ sung giống và lên men trên máy lắc tròn với tốc độ 220 vòng/ phút. Sau 96 giờ lên men xác định HTKS trong dịch lên men bằng phương pháp đục lỗ thạch.
2.2.5.3. Ảnh hưởng của nguồn Nitơ
Bổ sung nguồn Nitơ (%): Cao nấm men, bột đậu tương, (NH4)2SO4 và KNO3 vào hỗn hợp dung dịch muối đã bổ sung thêm 1,5% glucoza. Sau đó bổ sung giống rồi lên men và thử HTKS bằng phương pháp đục lỗ.
2.2.6. Các phƣơng pháp sinh học phân tử trong phân lập gen 16S - rRNA 2.2.6.1. Tách chiết DNA của xạ khuẩn bằng đệm CTAB 2.2.6.1. Tách chiết DNA của xạ khuẩn bằng đệm CTAB
Nguyên tắc:
Phá vỡ thành tế bào của xạ khuẩn nhờ lyzozym. Loại bỏ protein khỏi DNA nhờ các enzym protease K. Phân tách các thành phần của tế bào sau khi phá vỡ thành hai pha nhờ dung dịch đệm chlorofom: isoamyl alcohol (24:1): pha trên chứa cặn tế bào, pha dưới chứa axit nucleic. Sau cùng, DNA được tủa bằng ethanol tuyệt đối (đã được làm lạnh - 22), được làm khô và hòa tan trong đệm TE [39].
Tiến hành:
-34-
Hòa tan cặn tế bào trong 0,8 ml TE 25S, lắc đều bằng vontex. Bổ sung 40 µl lysozym, ủ ở 370C trong 90 phút (nồng độ cuối cùng của lysozym là 2mg/ ml).
Bổ sung 10 µl protease K, mix đều, thêm 60 µl 10% SDS, đảo nhẹ, ủ 1giờ ở nhiệt độ 550C (nồng độ cuối cùng của protease K là 0,18mg/ml, SDS là 0,5%).
Bổ sung 150 µl NaCl 5M, mix đều. Sau đó bổ sung 130 µl CTAB, mix đều, ủ 10 phút ở 550
C.
Đặt ở nhiệt độ phòng 5 phút, chia đều ra 2 ống eppendorf mới. Sau đó bổ sung vào mỗi ống 700 µl chlorofom/ isoamyl alcohol, mix đều 15 phút. Ly tâm 9000 vòng/phút trong 20 phút để tách pha.
Chuyển dịch pha trên sang các eppendorf mới và bổ sung 0,6V isopropanol, đảo nhẹ. Đặt trong tủ - 200C trong 30 - 40 phút. Ly tâm 9000 vòng/phút, rửa tủa bằng etanol 70%. Hòa tan DNA trong 100 µl TE.
2.2.6.2. Khuếch đại gen rRNA - 16S bằng phản ứng PCR Nguyên tắc:
PCR là phản ứng trùng hợp, cho phép khuếch đại một đoạn DNA cụ thể lên hàng triệu lần nhờ sự xúc tác của DNA polymerase chịu nhiệt. Enzym này có khả năng hoạt động ở nhiệt độ cao. Sự hoạt động của enzym được kiểm soát của một chu kỳ nhiệt xác định. Đoạn DNA được tổng hợp được giới hạn về mặt kích thước bởi một cặp mồi đặc hiệu.
Cặp mồi được sử dụng trong nghiên cứu có trình tự là:
Trình tự mồi: Mồi xuôi 27 5' - agagtttgatcctggctcag - 3' 27- 47 Mồi ngược 1525 5'
- aaaggaggtgatccagcc - 3' 1525 -1507
-35- Thành phần phản ứng Chu kỳ nhiệt H2O 17,1µl Buffer (10X) 2,5µl dNTP (2,5mM) 2µl Primer 1 (10pml) 1µl Primer 2 (10pml) 1µl ADN khuôn 1µl Enzyme Taq 0,4µl 940C 3 phút 940C 1 phút 640C 1 phút 720C 1 phút 30 giây 40C ∞ Tổng 25µl
2.2.5.3. Phương pháp điện di trên gel agarose
Phương pháp điện di trên gel agrose được sử dụng để kiểm tra DNA plasmid, kiểm tra các phân đoạn DNA được nhân bằng kỹ thuật PCR và kiểm tra kết quả cắt giới hạn. Phương pháp này được chia làm một số bước như sau:
- Chuẩn bị gel agarose: cân một lượng agarose tương ứng (tùy theo nồng độ gel yêu cầu) vào trong dung dịch 100ml TAE 1X. Đun sôi bằng lò vi sóng, để nguội xuống khoảng 500C rồi đổ dung dịch vào bản gel đã cài sẵn lược. Sau khoảng 30 phút, đặt bản gel vào bể điện di và đổ dung dịch điện di TAE ngập bản gel.
- Tra mẫu: lấy 1 - 2 g DNA pha loãng trong 16 l đệm TE, sau đó bổ sung 4 l dye mầu. Một lượng DNA maker tương ứng cũng được tra vào bản gel trước khi điện di.
-Điện di: Điện di tại hiệu điện thế không đổi 100V trong khoảng 20 - 30 phút. Quan sát sự di động của DNA từ cực âm sang cực dương thông qua dye mầu.
-36-
- Nhuộm bản gel: Bản gel sau điện di được ngâm vào dung dịch thuốc nhuộm EtBr nồng độ 2 g/ml trong khoảng 10 phút, lắc nhẹ trên máy lắc, sau đó soi gel trên đèn UV và chụp ảnh bằng máy chụp gel của hãng Bio - Rad.
2.2.7. Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả nghiên cứu được chúng tôi xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên phần mềm Excel.
-37-
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và thuần khiết các chủng nấm gây bệnh trên chè
Từ các mẫu chè bị bệnh thu thập ở các khu vực khác nhau của tỉnh Thái Nguyên, chúng tôi đã phân lập và thuần khiết được 3 chủng nấm được ký hiệu là CT - 1A, CT - 2E và CT - 5X.
Các chủng nấm phân lập được đều có đặc điểm chung là: các sợi nấm đều không có màu sắc, sợi nấm có vách ngăn (hình 3.1). Mỗi chủng nấm được phân lập từ một mẫu chè có biểu hiện bệnh khác nhau. Kết quả được trình bày trên bảng 3.1.
Bảng 3.1. Đặc điểm một số mẫu chè làm nguồn phân lập các chủng nấm Ký hiệu chủng nấm Nguồn phân lập Biểu hiện bệnh CT - 1A Lá chè non Trên bề mặt lá và mép lá có nhiều đốm nâu CT - 2E Lá chè non
Vết bệnh có màu nâu sẫm, lúc đầu chỉ có chấm nhỏ màu đen, sau đó lan ra khắp lá.
CT - 5X Lá chè non Các lá bị xoăn, trên mặt lá có thể bị
nhăn.
Sau khi được tinh sạch, 3 chủng nấm trên được giữ trong ống thạch nghiêng trên môi trường Czapek và được sử dụng làm VSV kiểm định để tuyển chọn xạ khuẩn sau này.
-38-
Chủng CT - 1A Chủng CT - 2E
Chủng CT - 5X
Hình 3.1. Ba chủng nấm phân lập từ các mẫu chè bị bệnh 3.2. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn
3.2.1. Hoạt tính kháng nấm của các chủng xạ khuẩn
Từ các mẫu đất lấy ở độ sâu 5 - 10 cm tại các địa điểm khác nhau thuộc tỉnh Thái Nguyên, chúng tôi đã phân lập và thuần khiết được 80 chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces. Sau khi thử HTKS theo phương pháp khuếch tán trên thạch với 3 chủng nấm CT - 1A, CT - 2E, CT - 5X, chúng tôi đã tuyển chọn sơ bộ được 30 chủng trong tổng số 80 chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm ở các mức độ khác nhau, chiếm tỷ lệ 37,5%. So sánh với tỷ lệ chủng xạ khuẩn kháng nấm gây bệnh đạo ôn đã công bố trước đây cùa Lê Gia Hy và cộng sự [18], tỷ lệ chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên chè của chúng tôi có phần cao hơn.
-39-
Bảng 3.2. Xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu Nhóm màu xạ khuẩn Các chủng có HTKN Tỷ lệ chủng có HTKN so với tổng số (%) Số lượng Tỷ lệ(%) Trắng (Allbus) 11 36,7 13,7 Xám (Griseus) 8 26,7 10,0 Xanh (Azeureus) 7 23,3 8,6 Hồng (Roseus) 2 6,7 2,6 Nâu (Chromogenes) 1 3,3 1,3 Lục (Viridis) 1 3,3 1,3 Tổng cộng 30 100 37,5
Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm phân chia theo nhóm màu của Shirling và Gottlieb [37]. Kết quả được thể hiện trên bảng 3.2 và hình 3.2.
-40-
Kết quả trên bảng 3.2 cho thấy: số lượng chủng có hoạt tính nhiều nhất là nhóm trắng chiếm 36,7%, sau đó là nhóm xám - 26,7%, nhóm xanh - 25,3%, nhóm hồng - 6,7% và ít nhất là các nhóm nâu và lục đều chiếm 3,3%. Kết quả này của chúng tôi cũng phù hợp với những nghiên cứu của một số tác giả trước đây [14],[18].
Đồng thời chúng tôi cũng nhận thấy khả năng đối kháng của các chủng xạ khuẩn với 3 chủng nấm gây bệnh trên chè có sự khác nhau (bảng 3.3).
Bảng 3. 3. Tính đối kháng của xạ khuẩn với 3 chủng nấm gây bệnh trên chè Chủng XK có HTKN 3 chủng nấm gây bệnh chè CT - 1A CT - 2E CT - 5X Kháng cả 3 chủng Số lượng 9 16 13 4 Tỷ lệ (%) 30 53 43 13,3 Trong tổng số 30 chủng có hoạt tính kháng nấm, số chủng kháng nấm CT - 2E là cao nhất, có 16 chủng (chiếm 53% ), tiếp theo là số chủng kháng nấm CT - 5X, có 13 chủng (chiếm 43%) và ít nhất là chủng kháng nấm CT - 1A có 9 chủng (chiếm 30%).
-41-
Đáng chú ý trong số đó, có 4 chủng có khả năng kháng được cả 3 chủng nấm, chiếm tỷ lệ 13,3%, các chủng còn lại phần lớn chỉ kháng được 1 đến 2 chủng nấm. Tỷ lệ các chủng kháng nấm được thể hiện trên hình 3.3.
3.2.2. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có HTKN cao
Sau khi đã tuyển chọn sơ bộ được 30 chủng có hoạt tính kháng nấm, chúng tôi đã chọn ra 2 chủng có hoạt tính kháng nấm mạnh nhất được ký hiệu là: Đ1 và R2. Ở bước này, các chủng được nuôi lắc trong môi trường dịch thể ISP - 4 để thu dịch nuôi cấy. Kết quả kiểm tra hoạt tính của dịch nuôi cấy theo phương pháp đục lỗ với các chủng nấm như trên được thể hiện trên bảng 3.4 và hình 3.4.
Bảng 3. 4. Hoạt tính kháng nấm của 3 chủng xạ khuẩn Chủng xạ khuẩn Hoạt tính kháng nấm (D- d, mm) CT - 1A CT - 2E CT - 5X Đ1 12 14 15 R2 12 16 17
Kết quả trên bảng 3.4 cho thấy: mặc dù cả 2 chủng xạ khuẩn lựa chọn đều vẫn giữ được hoạt tính kháng nấm, song mức độ kháng đối với các chủng nấm có sự khác nhau. Khả năng kháng nấm CT - 1A của cả 2 chủng xạ khuẩn đều yếu nhất và khả năng kháng chủng CT - 5X của 2 chủng xạ khuẩn là cao nhất.
Chúng tôi tiếp tục tiến hành nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại của 2 chủng xạ khuẩn Đ1 và R2. Hai chủng xạ khuẩn này thuộc hai nhóm màu khác nhau. Chủng Đ1 thuộc nhóm màu trắng và chủng R2 thuộc nhóm màu nâu.
-42-
VSV kiểm định: CT - 5X VSV kiểm định: CT - 2E
Hình 3.4. Hoạt tính kháng nấm của 2 chủng xạ khuẩn lựa chọn 3.3. Đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của 2 chủng XK Đ1 và R2
3.3.1. Đặc điểm hình thái
Chủng R2 có cuống sinh bào tử dạng xoắn, bề mặt bào tử có dạng gai. Chủng Đ1 có cuống sinh bào tử dạng thẳng, bề mặt bào tử xù xì.
Hình 3. 5. Cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử chủng R2
R2 D1
ĐC ĐC
-43-
Hình 3.6. Cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử chủng Đ1
3.3.2.Đặc điểm nuôi cấy
Xạ khuẩn được nuôi cấy trên các môi trường khác nhau để quan sát khả năng sinh trưởng của xạ khuẩn và màu sắc của hệ khuẩn ty. Kết quả cho thấy xạ khuẩn rất đa dạng về màu sắc khi nuôi cấy trên các môi trường khác nhau. Tùy theo thành phần của môi trường nuôi cấy mà màu sắc khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh hay sắc tố hòa tan tiết ra khác nhau. Các đặc điểm nuôi cấy của 2 chủng R2 và Đ1 được trình bày trên bảng 3.5 cho thấy:
Đối với chủng Đ1: khi nuôi cấy trên các môi trường ISP - 1, ISP - 2, ISP - 3, ISP - 5, ISP - 7 màu sắc của KTKS và KTCC đều có màu trắng. Trên môi trường ISP - 4 màu sắc HSCC có màu xám và HSKS có màu trắng. Ở môi trường ISP - 6 màu sắc của HSKS có màu vàng và HSCC có màu trắng.
Đối với chủng R2: màu sắc của HSCC và HSKS có đa dạng hơn khi nuôi cấy trên các môi trường ISP khác nhau.
-44-
Bảng 3. 5:Đặc điểm nuôi cấy của chủng R2 và Đ1 Môi
trƣờng
Chủng Đ1 Chủng R2
HSCC HSKS Sắc tố HSCC HSKS Sắc tố
ISP - 1 Trắng Trắng Không màu Nâu Trắng Không màu
ISP - 2 Trắng Trắng Không màu Nâu Xám ghi Không màu
ISP - 3 Trắng Trắng Không màu Trắng
ngà Xám ghi Không màu
ISP - 4 Xám Trắng Không màu Trắng Xám Không màu
ISP - 5 Trắng Trắng Không màu Trắng
ghi nâu
Trắng
ghi xanh Không màu
ISP - 6 Trắng Vàng Không màu Nâu Xám ghi
(yếu) Melanin
ISP - 7 Trắng Trắng Không màu Nâu Xám ghi Nâu
* Khả năng hình thành sắc tố melanin
Chủng R2 và Đ1 được nuôi cấy trên môi trường ISP - 6 ở nhiệt độ 300C. Sau 14 ngày quan sát chúng tôi nhận thấy:
Hình 3.7. Khả năng hình thành sắc tố melanin của 2 chủng
-45-
Đối với chủng Đ1 màu sắc của môi trường không có sự biến đổi, tức là không có khả năng hình thành sắc tố melanin.
Đối với chủng R2 màu sắc của môi trường biến đổi từ màu vàng nhạt sang màu nâu đậm, điều đó có nghĩa là chủng R2 có khả năng hình thành sắc tố melanin trên môi trường có chứa sắt.
3.3.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa
* Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon
Để đánh giá khả năng đồng hóa các nguồn cacbon khác nhau, chúng tôi tiến hành nuôi 2 chủng R2 và Đ1 trên môi trường ISP - 9 có bổ sung các nguồn cacbon khác nhau với nồng độ 1%. Sau 7 - 14 ngày nuôi cấy, kết quả được thể hiện trên bảng 3. 6.
Bảng 3.6. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của 2 chủng xạ khuẩn Đ1 và R2
Nguồn cacbon Mức độ sinh trƣởng
Chủng Đ1 Chủng R2 Glucose ++++ ++++ Saccharose ++++ ++ Fructose ++++ ++ Lactose - ++++ Manitol ++++ ++++ Dextrin ++ ++++ Cellulose + + Arabinose - +++
Ghi chú: ++++: Sinh trưởng rất tốt; +++: Sinh trưởng tốt;
-46-
Kết quả trên bảng 3.6 cho thấy:
Cả 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu đều có khả năng đồng hóa tốt các nguồn cacbon khác nhau. Song chủng R2 đồng hóa tốt nhất nguồn cacbon là: Glucose, Lactose, Manitol, Dextrin và sinh trưởng yếu nhất trong môi trường có chứa nguồn cacbon Cellulose.
Đối với chủng Đ1 có khả năng đồng hóa tốt nguồn cacbon Glucose, Saccharose, Fructose, Manitol và không có khả năng đồng hóa 2 nguồn cacbon là Lactose, Arabinose.
* Nhiệt độ sinh trưởng thích hợp
Chủng R2 và Đ1 được nuôi ở các thang nhiệt độ khác nhau. Khả năng sinh trưởng của 2 chủng được thể hiện trên bảng 3.7.
Bảng 3. 7: Nhiệt độ sinh trƣởng thích hợp của 2 chủng XK
Nhiệt độ Chủng 25 0 280 300 320 350 400 R2 + +++ +++ ++ + + Đ1 ++ +++ +++ + + -
Ghi chú: +++: Sinh trưởng tốt; ++: Sinh trưởng bình thường; +: Sinh trưởng yếu; -: Không sinh trưởng.
Kết quả trên bảng 3.6 cho thấy, hai chủng R2 và Đ1 có khả năng sinh trưởng trong khoảng nhiệt độ từ 250 - 320C, chủng R2 sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 280 - 300C và sinh trưởng yếu ở nhiệt độ 350 - 400C. Chủng Đ1 cũng sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 280 - 300C và không sinh trưởng ở nhiệt độ 400C. Như vậy nhiệt độ thích hợp cho cả 2 chủng phát triển tốt là 28 - 300C.
* Khả năng chịu muối
Hai chủng R2 và Đ1 được nuôi cấy trong môi trường ISP - 1 có bổ