- Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy Boetus (Đức), hoặc trên máy Eletronthermal IA–9200.
chiều dài di chuyển của chất thử chiều dài di chuyển của dung môi Rf =
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT - 410 dạng viên nén KBr. - Phổ 1H-NMR và 13C-NMR ghi trên máy Bruker 500MHz, nội chuẩn TMS, dung môi CDCl3, DMSO, aceton-D6.
2.3. Các dịch chiết từ cây hàn the (Desmodium heterophyllum – Papilionaceac)
2.3.1. Các dịch chiết
Toàn bộ phần trên mặt đất của cây hàn the đã phơi khô ở nơi thoáng ít nắng to, nghiền nhỏ được ngâm chiết kiệt bằng etanol ở nhiệt độ phòng cho đến khi thu được dịch không màu. Dịch chiết được cất loại hết dung môi ở áp suất giảm đến dạng cao khô, xác định khối lượng cặn khô, sau đó thêm nước vào cặn và lần lượt chiết với các loại dung môi: n-hexan, clorofom, etylaxetat và n-butanol.
Các dịch chiết nói trên được làm khan bằng Na2SO4, lọc và cất kiệt dung môi bằng cất quay dưới áp suất giảm ở nhiệt độ ≤ 500 C. Cặn được sấy khô và cân để xác định trọng lượng. Như vậy từ toàn bộ phần trên mặt đất (thân, lá) của cây hàn the đã thu nhận được 4 phân đoạn (4 loại cặn) là n- hexan, clorofom, etylaxetat và n-butanol với các ký hiệu tương ứng là: cặn trong n-hexan (PH), cặn trong clorofom (PC), cặn trong etylaxetat (PE) và cặn trong n-butanol (PB).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Sơ đồ 2.1: Quy trình ngâm chiết mẫu
Bảng 2.1: Khối lƣợng chất tổng số đƣợc chiết từng phân đoạn của cây hàn the (Desmodium heterophyllum – Papilionaceac)
Khối lƣợng nguyên liệu khô
(g)
Khối lƣợng cặn etanol tổng số (g)
Khối lƣợng cặn chiết (g)
n-Hexan Clorofom Etylaxetat n-Butanol
1150 220,4 40,07 24,45 20,28 49,28
2.3.2. Khảo sát định tính các dịch chiết
2.3.2.1. Xác định đƣờng khử.
- Lấy 4-5 ml dịch chiết trong etanol ( cặn tổng) với 4-5 ml thuốc thử Felinh, đun sôi 2-3 phút, nếu có kết tủa da cam của Cu2O chứng tỏ có mặt đường.
2.3.2.2. Xác định định tính ankaloit.
- Xác định bằng thuốc thử Dragendooc. Thuốc thử Dragendooc được chuẩn bị từ hai dung dịch sau:
Mẫu khô cắt nhỏ Cặn n-hexan PH Cặn CHCl3 PC Cặn EtOAc PE Cặn n-BuOH PB PH1 PH2 PC1 PE1 1. Etanol 2. Cặn trong nƣớc
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Dung dịch 1: Lấy 0,85 gam NaHSO3 hoà tan trong 40ml nước cất và 10ml axit axetic băng
Dung dịch 2: Lấy 8 gam KI hoà tan trong 20ml nước cất.
Lấy 2ml dung dịch 1 trộn với 5ml dung dịch 2 và thêm 20ml axit axetic sau đó thêm nước đến 100ml là được thuốc thử Dragendooc.
Nếu có mặt ancaloit thì thấy xuất hiện màu da cam sáng khi cho dịch chiết tác dụng với thuốc thử Dragendooc.
2.3.2.3. Xác định định tính steroit
- Phản ứng màu Libecman-Bơcsa. Thực hiện theo 2 cách:
Cách 1: Thực hiện theo Ston: Cho vài ml dịch chiết tổng vào ống nghiệm, thêm vài giọt CH3COOH đặc và vài ml hỗn hợp (CH3CO)2O : H2SO4 (50:1). Màu thay đổi từ hồng sang xanh lá cây.
Cách 2: Thực hiện theo Brietcoc: cho vài mg dịch chiết trong CHCl3, thêm vào 2 ml thuốc thử (CH3CO)2O : H2SO4 (20:1). Màu sẽ chuyển từ đỏ- hồng- xanh lá cây- chàm tuỳ thuộc vào các loai steroit.
2.3.2.4. Xác định định tính flavonoit
- Phản ứng Xianidin: lấy 1 ml dịch chiết etylaxetat cho và ống nghiệm, thêm vài giọt HCl đặc + 1 mảnh Mg, đun nhẹ, dung dịch chuyển sang màu hồng.
- Phản ứng với NH3: chấm cặn dịch chiết etylaxetat vào mảnh giấy lọc rồi hơ trên lọ đựng NH3 đặc, màu vàng chỗ chấm đậm hơn chứng tỏ có flavonoit.
2.3.2.5. Xác định định tính poliphenol.
- Phản ứng với dung dịch FeCl3 1%: Lấy khoảng 1 ml dịch chiết etylaxetat phản ứng với FeCl3 1% , nếu phản ứng tạo ra màu xanh lục tức là dịch chiết có chất có gốc phenol.
2.3.2.6. Xác định định tính cumarin.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
NaOH 10%. Sau đun cả 2 ống nghiệm trên bếp cách thuỷ đến sôi rồi làm lạnh. Thêm vào mỗi ống 4 ml nước cất. Quan sát thấy chất lỏng ống 1 trong suốt hơn so với ống 2 và khi axit hoá bằng vài giọt HCl đặc nếu có kết tủa bông thì kết luận có cumarin.
2.3.2.7. Xác định định tính glycozit tim.
- Phản ứng Kelle-Kiliani: Thuốc thử Kelle-Kiliani gồm 2 dung dịch: Dung dịch 1: 100 ml CH3COOH loãng + 1ml FeCl3 5%
Dung dịch 2: 100 ml H2SO4 đặc + 1ml FeCl3 5%
Lấy vài mg cặn dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml dung dịch 1, lắc đều cho tan, thêm từ từ 1-2 ml dung dịch 2 theo thàmh ống nghiệm, quan sát sự xuất hiện màu giữa 2 lớp chất lỏng. Không xuất hiện màu là phản ứng âm tính với glycozit tim.
2.3.2.8. Xác định định tính saponin.
- Sự tạo bọt: Cho vào 2 ống nghiệm, ống 1 cho 5 ml dung dịch HCl 0,1N. Ống 2 cho 5 ml dung dịch NaOH 0,1N. Cho vào mỗi ống 3-5 giọt dịch chiết tổng, lắc đều, để yên, quan sát. Nếu độ bền của cội bọt ống 1 bền hơn ở ống 2 chứng tỏ mẫu nghiên cứu có saponin tritecpen, ngược lại có saponin steroit.
- Phản ứng màu Liberman: Dung dịch chiết + 2 ml (CH3CO)2O, lắc đều rồi cho từ từ H2SO4 đặc từ đáy lên, xuất hiện màu đỏ tím nếu có saponin.
2.4. Phân lập, tinh chế các chất từ cây hàn the (Desmodium heterophyllum
– Papilionaceac)
2.4.1. Dịch chiết n-hexan
Từ 25g cặn dịch n-hexan của toàn bộ phần trên mặt đất (thân, lá) của cây hàn the, kí hiệu (PH) được tiến hành phân lập các chất trên sắc kí cột silicagel. Hệ dung môi rửa giải là n-hexan : etylaxetat với tỷ lệ theo độ tăng dần của độ phân cực dung môi từ 0 đến 100% etylaxetat ( Cụ thể: hệ dung
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
môi n-hexan:etylaxetat lần lượt các tỉ lệ 95-5, 90-10, 85-15…đến 0-100) Các phân đoạn được thu từng lọ nhỏ, được kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng (bản mỏng), các phân đoạn giống nhau đem gộp lại và cất loại dung môi đã thu được chất sạch.
2.4.1.1. Chất PH1 (Stigmasterol)
Rửa giải cột bằng hệ dung môi n-hexan - etylaxetat (95:5). Sau khi cất loại dung môi, cặn thu được kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng trong hệ dung môi A,(n-hexan: etylaxetat 85:15), phát hiện bằng vanilin 1% trong dung dịch metanol-H2SO4 5%, thu được chất rắn ở dạng tinh thể hình kim, không màu, khối lượng 25 mg. Nhiệt độ nóng chảy đo được là 156-1580C, Rf = 0,8 trong hệ dung môi A.
Tiến hành đo phổ chất PH1 và so sánh các thông tin phổ đo được chúng tôi thấy các thông số tương đương phổ của stigmasterol.
2.4.1.2. Chất PH2: Glycozit của stigmasterol
Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi n-hexan - etylaxetat (30:70). Sau khi cất loại dung môi, cặn thu được kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng trong hệ dung môi B (n-hexan: etylaxetat 20:80), phát hiện nó bằng vanilin 1% trong dung dịch metanol-H2SO4 5%, thu được 15 mg tinh thể dạng vô định hình màu trắng. Đo nhiệt độ nóng chảy được 288-2900
C, Rf = 0,65 trong hệ dung môi B. So sánh các thông tin trên phổ 1H-NMR với phổ gốc, phân tích các dung dịch thuỷ phân và phần gennin với các chất mẫu ở phòng thí nghiệm chúng tôi kết luận chất PH2 là Stigmasterol.3--D- glucopyranozyl.
2.4.2. Dịch chiết Clorofom (PC1)
- Từ 17,5 g cặn dịch Clorofom của toàn bộ phần trên mặt đất (thân, lá) của cây hàn the, kí hiệu (PC1) được tiến hành phân lập các chất trên sắc kí cột silicagel. Hệ dung môi rửa giải là etylaxetat : metanol với tỷ lệ theo độ tăng dần của độ phân cực dung môi từ 0 đến 100% etylaxetat (Cụ thể là hệ dung
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
môi etylaxetat : metanol lần lượt các tỉ lệ 95-5, 90-10, 85-15…đến 0-100). Các phân đoạn được thu từng lọ nhỏ, được kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng (bản mỏng), thuốc thử phát hiện là vanilin 1% trong dung dịch metanol- H2SO4 5%. Kết quả: ở hệ dung môi rửa giải etylaxetat: metanol (70-30) Sau khi cất loại dung môi, cặn thu được kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng trong hệ dung môi D (cloroform – metanol -30:10) và hệ E (4:1:5), thu được 10 mg tinh thể dạng bột màu vàng nâu. Rf = 0,65 trong hệ dung môi D, Rf = 0,45 trong hệ dung môi E. Nhiệt độ nóng chảy đo được là 275-2780
C.
Tiến hành đo phổ 1H-NMR, kết quả cho thấy chất đo chưa được tinh khiết, chúng tôi thuỷ trong axit chất thu được, phân tích dịch thuỷ phân cho thấy có đường glucozơ, phần gennin cho phổ phù hợp với phổ 1H-NMR tương tự phổ của -sitosterol, từ kết quả đó chúng tôi dự đoán chất (PC1) là glycozit của -sitosterol.
2.4.3. Dịch chiết Etylaxetat (PE1)
- Làm tương tự như các phần 2.4.1 và 2.4.2, từ 20,4 g cặn dịch chiết EtOAc đem tách trên cột silicagel, rửa giải cột bằng hệ dung môi etylaxetat: metanol tăng dần theo độ phân cực (0-100% metanol), kiểm tra các phân đoạn trên sắc kí lớp mỏng ( 5-10ml/phân đoạn).Thuốc thử phát hiện bằng vanilin 1% trong dung dịch metanol-H2SO4 5%, thu được khoảng 35 mg chất bột màu vàng. Lượng chất bột này được tinh chế lại trên cột silicagel, rửa giải cột bằng hệ dung môi etylaxetat: metanol từ 97-3, 95-5, 90-10, 85-15. Kiểm tra cặn thu được bằng hệ dung môi C (cloroform : metanol – 90:10) và kiểm tra bằng hơi NH3 đặc, thu được 12 mg chất bột màu vàng. Nhiệt độ nóng chảy đo được là 271-2740C, Rf = 0,55 trong hệ dung môi C.
- Tiến hành đo phổ chất bột vàng này thu được các thông tin phổ như sau: Phổ 1H-NMR (500MHz, DMSO-1H). δ(ppm): 13,15 (1H, S, OH); 8,01 (2H, d, J= 8, H-2’ và H-6’); 6,90 (2H, d, J =10, H-3’, H-5’); 6,26 (1H, S, H-6);
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 6,76 (1H, S, H-3); 4,96 (1H, d, J= 11, H-1”); 4,6 ( 1H, t, H-2”); 3,82 (1H, m, H-6”); 3,70 (1H, t, H-3’); 3,52 (1H, m, H-4”); 3,45 (1H, m, H-5”) Phổ 13 C-NMR (DMSO-C13CPD): 163,78 (C-2); 103,8 (C-3); 181,88 (C-4); 160,31(C-5); 98,04 (C-6); 160,97 (C-7); 104,48 (C-8); 154,82 (C-9), 102,34 (C-10); 121,51 (C-1’); 128,69 (C-2’); 115,71 (C-3’); 160,98 (C-4’); 115,71 (C-5’); 160,98 (C-6’); 73,38 (C-1”); 70,84 (C-2”); 78,59 (C-3”); 70,53 (C-4”); 81,62 (C-5”); 61,14 (C-6”).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
CHƢƠNG III
THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Xác định định tính các nhóm chất thiên nhiên trong cây hàn the
(Desmodium heterophyllum – Papilionaceac)
Trước khi tiến hành phân lập và xác định cấu trúc của các chất hợp chất hữu cơ thiên nhiên có trong thực vật, việc đầu tiên là phải thử định tính để nhận dạng các nhóm chất. Để xác định định tính các nhóm hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học có trong thực vật, thuốc thử thường dùng là phân tích bằng các phản ứng đặc trưng đối với mỗi nhóm chất, cụ thể đã được mô tả ở phần 2.3.2. Kết quả thử định tính các nhóm chất trong cây hàn the (Desmodium heterophyllum) như sau:
Bảng 3.1: Phát hiện các nhóm chất trong cây hàn the
STT Nhóm chất Thuốc thử đặc hiệu Hiện tƣợng Kết quả
1 Đường khử Felinh Cho kết tủa màu đỏ gạch ++ 2 Ankaloit Dragendooc Màu vàng da cam + 3 Steroit Libecman-Bơcsa Từ hồng đến xanh lá cây ++
4 Flavonoit
Xianidin Từ vàng da cam, đến hồng,
đến đỏ ++
NH3 đặc Màu vàng đậm hơn ++ 5 Poliphenol FeCl3 1% Màu xanh lục ++ 6 Cumarin Axit và kiềm Kết tủa bông ++ 7 Glycozit tim Kelle-Kiliani Không có hiện tượng gì - 8 Saponin
Liberman Màu đỏ tím ++
Tạo bọt Bọt bền trong kiềm ++ Ghi chú: Dấu (+): Phản ứng dương tính. Dấu: (++):Phản ứng dương tính
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Từ kết quả này có thể nhận thấy trong cây (Desmodium heterophyllum) ít nhất có chứa tới 7 nhóm hợp chất thiên nhiên quan trọng đó là: đường khử, ankaloit, steroit, flavonoit, poli phenol, cumarin và saponin. Không phát hiện thấy glycozit tim có trong các mẫu thử. Từ kết quả phân tích định tính cũng sơ bộ cho thấy cây hàn the là thực vật chứa nhiều chất có hoạt tính sinh học cao. Trong đó có nhiều hợp chất có thể có tác dụng chữa bệnh, đúng như kinh nghiệm của các lương y dân gian.
3.2. Phân lập và nhận dạng các hợp chất có trong các dịch chiết khác nhau của cây hàn the nhau của cây hàn the
Các dịch chiết phân đoạn thu được từ cây hàn the (Desmodium heterophyllum) theo sơ đồ 2.1 đều là những hỗn hợp phức tạp chứa các hợp chất khác nhau, có độ phân cực gần nhau. Để phân lập từng chất ra khỏi hỗn hợp, chúng tôi đã sử dụng phương pháp sắc ký cột với chất hấp phụ silicagel, các hệ dung môi rửa giải có độ phân cực tăng dần, phù hợp và thường phải lặp lại nhiều lần. Việc tinh chế các chất thường dùng là kết tinh lại trong dung môi hoặc hệ dung môi thích hợp và thử sắc kí lớp mỏng với nhiều hệ thử khác nhau. Nhờ đó mới thu được các hợp chất có độ tinh khiết cao để đáp ứng các nhu cầu khảo sát tính chất hóa lý và quang phổ của chúng. Đó chính là những yếu tố quan trọng trong quá trình nhận dạng và xác định cấu trúc hóa học của các chất đã phân lập được từ các đối tượng nghiên cứu nói trên.
Việc phân lập các thành phần hóa học từ cây hàn the được thực hiện như sơ đồ 2.1. Kết quả đã thu được các hợp chất sạch gồm các nhóm chất: steroit, glycozit của -sitosterol và glycozit của flavonoit.
3.2.1. Chất PH1: Stigmast-5,22-dien-24R-3 -ol
Thu được từ cặn n-hexan của thực vật hàn the chất rắn ở dạng tinh thể hình kim, không màu, khối lượng 25 mg. Nhiệt độ nóng chảy đo được là 156-1580C, Rf = 0,8 trong hệ dung môi A.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Phổ FT-IR cho phép khẳng định sự có mặt của nhóm OH max= 3406
cm-1, còn phổ 1H-NMR cho H3= 3,58 ppm. Có 2 nối đôi không liên hợp với
ax
m
= 1621 cm-1
, còn trong phổ 1H-NMR có 3 H ở các nhóm metin (C-H) liên kết với cacbon chưa no ở các nối đôi trên với H-6 = 5,37 và H-22 = 5,15 ppm, J = 15HZ và 7 HZ và H-23 = 5,02, J = 15 và 7 HZ)
So sánh các dữ liệu phổ FT-IR, phổ 1H-NMR, nhiệt độ nóng chảy, các hằng số vật lí khác của chất PH1 với stigmasterol của phòng thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy chúng hoàn toàn tương tự nhau. Vì vậy, chúng tôi có thể quy kết chất PH1 là stigmast-5,22-dien-24R-3 -ol, còn gọi là stigmasterol.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.2.2. Chất PH2: 3-O--D- glucopyranozyl stigmasterol
Chất PH2 là chất rắn vô định hình, tan được trong etylaxetat, trong metanol, dễ tan trong hỗn hợp dung môi n-hexan-etylaxetat (2:8), có nhiệt độ nóng chảy ở 288-2900C.
Thuỷ phân chất PH2 trong dung dịch HCl 2N thu được stigmasterol, phổ
1
H-NMR của sản phẩm sau thuỷ phân không còn những tín hiệu của phần đường và hoàn toàn tương tự như phổ của stigmasterol. Phần dung dịch được phân tích bằng sắc kí, so sánh với các đường mẫu chuẩn của của phòng thí nghiệm cho thấy tương ứng với đường glucozơ.
Phân tích phổ 1H-NMR của chất PH2 cũng cho thấy các phần rõ rệt tương ứng với phổ 1
H-NMR của stigmasterol và phần đường tương ứng với các độ chuyển dịch hoá học của các H trong phần đường (H3từ 3,24 đến 4,5 ppm). Từ các dữ kiện thực nghiệm trên chúng tôi cho rằng chất PH2 là 3-O--D- glucopyranozyl stigmasterol
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn