6.1 Định nghĩa
Laccase (p- benzenediol:oxygen oxidoreductase, E.C.1.10.3.2) thuộc nhóm enzyme oxidase, cụ thể là polyphenol oxidase. Trong phân tử có chứa 4 nguyên tử đồng có khả năng oxy hóa cơ chất sử dụng phân tử oxy làm chất nhận điện tử. Khác với phần lớn các enzyme khác, laccase có phổ cơ chất rất đa dạng, bao gồm diphenol, polyphenol, các dẫn xuất phenol, diamine, amine thơm, benzenethiol, PCB, dioxin và cả các hợp chất vô cơ nhƣ iot. Các loại enzyme laccase tách chiết từ các nguồn khác nhau rất khác nhau về mức độ glycosyl hóa, khối lƣợng phân tử và tính chất động học [35].
6.2 Cấu trúc phân tử của laccase
Một loài sinh vật có thể có nhiều dạng isozyme của laccase, các dạng isozyme này khác nhau về trình tự acid amine và một số tính chất về động học xúc tác. Nấm có thể tạo ra nhiều dạng isozyme laccase khác nhau cả về mức độ glycosyl hóa và cả thành phần các gốc carbonhydrate. Trametes versicolor có 5 dạng isozyme chỉ khác nhau về thành phần carbonhydrate, thành phần carbonhydrate của chúng thay đổi từ 10 – 45% so với khối lƣợng của thành phần protein. Phân tử laccase thƣờng là monomeric protein, chỉ một số là oligomeric protein, có khối lƣợng phân tử dao động trong khoảng 60 – 90kD. Phần lớn laccase của nấm có bản chất là glycoprotein với hàm lƣợng carbonhydrate chiếm khoảng 10 – 25% [34].
Tuy vậy, tất cả laccase đều giống nhau về cấu trúc trung tâm xúc tác với 4 nguyên tử đồng. Những nguyên tử đồng này đƣợc chia thành 3 nhóm: loại 1 (T1), loại 2 (T2) và loại 3 (T3), chúng khác nhau về tính chất hấp thụ ánh sáng và thế điện tử. Các nguyên tử đồng T1 và T2 có tính chất hấp phụ điện tử và tạo thành phổ điện tử mạnh, trong khi cặp nguyên tử đồng T3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
29
không tạo phổ hấp thụ điện tử, và có thể đƣợc hoạt hóa khi liên kết với anion mạnh.
Phân tử laccase thông thƣờng bao gồm 3 tiểu phần chính (vùng) A, B, C có khối lƣợng tƣơng đối bằng nhau, cả ba phần đều có vai trò trong quá trình xúc tác của laccase. Vị trí liên kết với cơ chất nằm ở khe giữa vùng B và C, trung tâm một nguyên tử đồng nằm ở vùng C và trung tâm ba nguyên tử đồng nằm ở bề mặt chung của vùng A và C. Trung tâm đồng một nguyên tử chỉ chứa 1 nguyên tử đồng T1, liên kết với một đoạn peptide có 2 gốc histidine và 1 gốc cystein. Liên kết giữa nguyên tử đồng T1 với nguyên tử S của cystein là liên kết đồng hóa trị bền và hấp thụ ánh sáng ở bƣớc sóng 600 nm, tạo cho laccase có màu xanh nƣớc biển đặc trƣng. Trung tâm đồng 3 nguyên tử có nguyên tử đồng T2 và cặp nguyên tử đồng T3. Nguyên tử đồng T2 liên kết với 2 gốc histidine bảo thủ trong khi các nguyên tử đồng T3 thì tạo liên kết với 6 gốc histidine bảo thủ (Hình 1.7, 1.8) [35].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
30
Hình 1.7. Hình ảnh không gian ba chiều của laccase từ M. albomyces
Tiểu phần A, B, C đƣợc kí hiệu đỏ, xanh lục và xanh lá cây
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
31
6.3 Cơ chế xúc tác của laccase
Laccase là enzyme oxy hóa khử có khả năng oxy hóa diphenol và các hợp chất có liên quan, sử dụng oxy phân tử làm chất nhận điện tử. Khác với phần lớn các loại enzyme khác, laccase có phổ đặc hiệu cơ chất khá rộng. Sự phù hợp của các cơ chất đối với laccase quyết định bởi hai nhân tố chính. Thứ nhất là sự phù hợp giữa cơ chất và nguyên tử đồng T1, thứ hai là sự phụ thuộc vào sự chênh lệch giữa thế oxy-hóa khử giữa cơ chất và enzyme. Các đại lƣợng này phụ thuộc cấu trúc hóa học của cơ chất. Thế oxy hóa khử của laccase dao động trong khoảng 0,4 đến 0,8 V [9]. Cơ chất khử bị mất một điện tử nhờ xúc tác laccase thƣờng tạo thành một gốc tự do, gốc tự do không bền này tiếp tục bị oxy hóa nhờ xúc tác bởi chính laccase đó hoặc tiếp tục các phản ứng không cần xúc tác enzyme nhƣ hydrate hóa, phân ly hoặc polymer hóa.
Trung tâm nguyên tử đồng một nguyên tử (T1) là nơi diễn ra phản ứng oxy hóa cơ chất. Cơ chất chuyển một điện tử cho nguyên tử đồng T1, biến nguyên tử đồng T1 (Cu2+) trở thành dạng Cu+, hình thành phân tử laccase có cả 4 nguyên tử đồng đều ở trạng thái khử (Cu+). Một chu kỳ xúc tác liên quan đến sự vận chuyển đồng thời 4 electron từ nguyên tử đồng T1 sang cụm nguyên tử đồng T2/T3 qua cầu tripeptide bảo thủ His-Cys-His. Phân tử oxy sau đó oxy hóa laccase dạng khử, tạo thành hợp chất trung gian peroxy, và cuối cùng bị khử thành nƣớc (Hình 1.9).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
32
Hình 1.9.Cơ chế xúc tác của laccase
Ngoài ra cơ chế xúc tác có thể xảy ra theo một trong các cơ chế sau. Cơ chế đơn giản nhất có thể diễn ra khi các cơ chất bị oxy hóa trực tiếp bởi trung tâm hoạt động do 4 nguyên tử đồng đảm nhiệm. Tuy nhiên, các phần tử cơ chất thƣờng có cấu tạo cồng kềnh hoặc có thế khử quá lớn, vì vậy chúng không thể tiếp cận đƣợc trung tâm phản ứng của phân tử laccase. Trong trƣờng hợp này cần một hợp chất hóa học trung gian (mediator). Hợp chất hóa học này có thể tiếp xúc với trung tâm phản ứng của laccase và bị laccase oxy hóa thành dạng gốc tự do [52]. Sau đó mediator ở dạng oxy hoá nhận một điện tƣ̉ của cơ chất và trở thành khƣ̉, tiếp tục tham gia vào chu kỳ xác tác. Ngƣợc lại, laccase sau khi cho mediator một điện tƣ̉ thì trở thành dạng khƣ̉, và sau đó bị oxy hoá thành dạng oxy hoá và tiếp tục tham gia vào chu kỳ xúc tác tiếp theo (Hình 1.10). Các mediator thƣờng phù hợp cho laccase là 3-Hydroxyanthranillic acid (HAA), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS), N- hydroxybenzo-trialzone (HBT), N-hydroxyphtaimide (HPI), violuric acid ( VLA) v.v [52]. Sƣ̣ tham gia của mediator đã làm tăng phổ cơ chất xúc tác và tính không đặc hiệu cơ chất của laccase.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
33
Hình 1.10. Các kiểu xúc tác của laccase