2.1.1. Vật liệu thực vật
Cỏc thớ nghiệm nghiờn cứu in vitrođược tiến hành trờn 2 giống khoai tõy nhập nội: Solara (Đức) và Diamant (Hà Lan) do Viện Khoa học Nụng nghiệp Việt Nam cung cấp.
Cỏc thớ nghiệm trờn đồng ruộng được tiến hành trờn củ bi tạo ra bằng kỹ thuật nuụi cấy mụ từ giống Solara và Diamant và cỏc giống nhập nội tương ứng làm đối chứng.
2.1.2. Hoỏ chất và thiết bị
Hoỏ chất: Mụi trường MS cơ bản, cỏc chất kớch thớch sinh trưởng NAA
(Naphthyl Acetic Acid), BAP (6-Benzyl Amino Purin), Agar, saccharose, NaOH, HCl, gelatin, NaCl 2,6-DI (2,6 diclophenolindophenol), KIO3 (Kali iot
dat), vitamin B6, vitamin C…
Thiết bị: Cỏc thiết bị nuụi cấy in vitro: Box cấy vụ trựng, nồi khử trựng, mỏy đo pH, Cõn điện tử Santorius (Đức), tủ sấy, mỏy ly tõm lạnh…
2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiờn cứu
Địa điểm: Thớ nghiệm nuụi cấy in vitro được thực hiện tại phũng Cụng nghệ tế bào thực vật. Cỏc thớ nghiệm phõn tớch chỉ tiờu húa sinh được thực hiện tại phũng thớ nghiệm Di truyền học - Khoa Sinh - Trường Đại học Sư phạm- Đại học Thỏi Nguyờn.
Thớ nghiệm phõn tớch hàm lượng khoỏng được thực hiện tại phũng thớ
nghiệm Trung tõm- Trường Đại học Nụng Lõm - Đại học Thỏi Nguyờn
Cỏc thớ nghiệm nghiờn cứu ngoài đồng ruộng được thực hiện tại Tổ 2-
Phường Quang Vinh- TP Thỏi Nguyờn.
2.2. Phƣơng phỏp nghiờn cứu
2.2.1. Phƣơng phỏp nghiờn cứu in vitro
2.2.1.1. Phƣơng phỏp nhõn chồi, tạo củ
* Ảnh hưởng của mật độ chồi cấy đến khả năng tạo củ bi trong ống nghiệm
Mụi trường nhõn chồi: MS cơ bản, bổ sung aga 1%, saccharose 2%,
NAA 0,2 mg/l và BAP 1,5 mg/l, pH= 5,8 [39].
Sử dụng bỡnh tam giỏc cú thể tớch 250ml, mỗi bỡnh đều chứa 30ml mụi trường nhõn chồi như trờn, chồi cấy vào cỏc bỡnh mụi trường đó chuẩn bị với mật độ:
8- 10 chồi/bỡnh 14-15 chồi/bỡnh
10- 11 chồi/bỡnh 16-17 chồi/bỡnh
12-13 chồi/bỡnh 18-19 chồi/bỡnh
Khi chồi khoai tõy trong bỡnh cao từ 5cm đến 7cm (sau 2-3 tuần) sẽ được sử dụng để tạo củ.
Mụi trường tạo củ tối thớch đó được nghiờn cứu với chất cảm ứng tạo củ là BAP 9,5mg/l, nền mụi trường MS cơ bản, 15% nước dừa, saccharose 8%, pH= 5,8. Mỗi bỡnh cõy đều được bổ sung 100ml mụi trường tạo củ và đặt trong buồng tối nhiệt độ 2720C [39]. Cỏc thớ nghiệm được nhắc lại 3 lần, mỗi cụng thức 30 bỡnh. Khả năng tạo củ được xỏc định sau 7 tuần nuụi cấy.
* Ảnh hưởng của vị trớ đoạn cắt đối với khả năng sinh trưởng của chồi và tạo củ bi in vitro: Sử dụng mụi trường nhõn chồi và tạo củ tối thớch đó được nghiờn cứu [39]; cỏc bỡnh tam giỏc 250ml đều được đổ lượng mụi trường nhõn chồi như nhau và cấy chồi với cựng mật độ (14 chồi/bỡnh), cỏc bỡnh thớ nghiệm được cấy cỏc đoạn chồi ở cỏc vị trớ khỏc nhau: đoạn cắt phần ngọn; đoạn cắt phần giữa thõn; đoạn cắt gần gốc.
Cỏc thớ nghiệm được nhắc lại 3 lần, mỗi cụng thức 30 bỡnh. Khả năng sinh trưởng của chồi được xỏc định sau 20 ngày nuụi cấy, khả năng tạo củ được xỏc định sau 7 tuần nuụi cấy.
2.2.1.2. Theo dừi bảo quản củ bi trong phũng thớ nghiệm và thời gian ngủ nghỉ của củ
* Theo dừi mức độ hao hụt củ bi trong thời gian bảo quản: Củ khoai tõy
bi sau khi thu hoạch, đem rửa sạch, để khụ, phõn loại củ theo 2 loại kớch thước (đường kớnh >0,5cm và <0,5cm) và bảo quản trong cỏc bỡnh tam giỏc thể tớch 500ml. Cỏc bỡnh củ được bảo quản trong phũng nuụi cấy (nhiệt độ 2720C) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
mỗi bỡnh bảo quản 200 củ.
Mức độ hao hụt củ bi được xỏc định bằng tỉ lệ củ bị hỏng so với số củ theo dừi trong thời gian bảo quản là 3 thỏng
* Theo dừi thời gian ngủ của củ bi: Củ khoai tõy bi sau khi thu hoạch, rửa sạch, để khụ, phõn loại kớch thước, dải đều củ bi trờn khay chứa cỏt và đặt trong buồng tối (nhiệt độ 2720C).Thường xuyờn tưới nước vào cỏc khay cỏt và loại bỏ củ bị hỏng.
Thời gian ngủ của củ bi được tớnh từ khi thu hoạch củ đến khi cú 50% số củ theo dừi nảy mầm. Cỏc thớ nghiệm được nhắc lại 3 lần, mỗi cụng thức được tiến hành trờn 150 củ.
* Theo dừi tỉ lệ nảy mầm của củ bi: Sau khi qua thời gian ngủ nghỉ, củ bi được trồng trờn đất ruộng và theo dừi tỉ lệ nảy mầm. Khả năng nảy mầm được xỏc định sau 15-20 ngày trồng.
2.2.2. Phƣơng phỏp nghiờn cứu ngoài đồng ruộng 2.2.2.1. Bố trớ thớ nghiệm
Thớ nghiệm được bố trớ hoàn toàn ngẫu nhiờn. Cỏc ụ thớ nghiệm cú diện tớch 10m2, khoai tõy được trồng theo kiểu hàng kộp, mật độ 9 khúm/m2.
Thớ nghiệm nghiờn cứu ảnh hưởng của thời gian trồng đến khả năng sinh trưởng, phỏt triển và cỏc yếu tố cấu thành năng suất của khoai tõy trồng từ củ bi được tiến hành ở 3 thời điểm trồng 20/10/2007; 27/11/2007; 10/12/2007 với củ bi tạo ra từ giống Diamant, Solara và cỏc giống đối chứng tương ứng.
2.2.2.2. Trồng, chăm súc và phũng trừ sõu bệnh
* Làm đất: Đất cú cấu tượng nhẹ, tơi xốp. Dọn sạch cỏ, phay tơi xốp độ sõu khoảng 30cm, đỏnh luống đụi rộng 120 cm (cả rónh), cao 15cm. Rắc đều trấu, vụi bột , phõn chồng và thuốc chống kiến đều trờn mặt luống sau đú đảo trộn đều với đất.
* Trồng khoai tõy: 1 tuần sau khi làm đất tiến hành trồng khoai tõy. Rónh được xẻ cỏch nhau 40cm và cỏch đều 2 mộp. Chọn những củ bi mầm bắt đầu xuất hiện, khụng để mầm dài, sẽ khú trồng và khi trồng mầm phỏt triển yếu. Đặt củ giống vào hốc, phủ đất sõu đều tay khoảng 3- 4 (cm).
* Chăm súc: Chế độ chăm súc cỏc giống đối chứng và thớ nghiệm là như nhau.
- Xới + vun gốc khoai tõy: Xới đất xung quanh gốc khoai tõy tạo độ tơi xốp và thoỏng khớ cho cõy phỏt triển. Sau khi trồng củ bi được 25 - 30 ngày - chiều cao cõy 6 - 7cm (đối chứng được 15 ngày) tiến hành xới quanh gốc, bún thỳc lần 1 và vun gốc. Sau khi cõy củ bi được 40 - 45 ngày, chiều cao cõy 19- 20cm (đối chứng được 30 ngày) tiến hành xới, bún thỳc và vun lần 2
- Tưới nước: Tưới nước hàng ngày trong 60 ngày đầu .
- Bún thỳc phõn và phun thuốc bảo vệ thực vật
Bảng 2.1. Chế độ chăm súc khoai tõy trờn đồng ruộng (vụ đụng-2007)
Chế độ
Chăm súc
Thời điểm sau
trồng (ngày) Chỉ tiờu Đơn vị tớnh Lượng
Bún lút - Phõn chuồng (phõn gà) kg /100m2 100 Trấu hun kg /100m2 50 Vụi bột kg /100m2 8 Thuốc chống kiến Bún thỳc lần 1 20 Đạm kg /100m 2 1kg Kali kg/100m2 1kg Bún thỳc lần 2 35 Lõn kg/100m2 5 kg Phũng mốc sương (2 lần) 15 Ridomil Mancozeb (25gr) 30
2.2.2.3. Chỉ tiờu theo dừi và phƣơng phỏp theo dừi
* Sinh trưởng và phỏt triển của khoai tõy
- Thời gian sinh trưởng (ngày): Là khoảng thời gian tớnh từ khi trồng đến khi thu hoạch (lỳc cú khoảng 1/3- 1/2 số lỏ trờn cõy khoai tõy chuyển sang màu vàng).
- Tỉ lệ khúm được thu hoạch (%): Tỉ lệ khúm cú củ/ tổng số hốc trồng.
- Chiều cao cõy (cm): Được đo từ giao điểm rễ với thõn đến điểm sinh trưởng của ngọn cao nhất.
- Tốc độ tăng trưởng chiều cao cõy (cm/cõy/ngày): Được xỏc định ở từng giai đoạn sinh trưởng khỏc nhau của cõy.
a h1 h2 n
Trong đú: a: là tốc độ tăng chiều cao cõy (cm/cõy/ngày). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
h1: là chiều cao cõy vào cuối giai đoạn theo dừi (cm).
h2: là chiều cao cõy ở đầu giai đoạn theo dừi (cm).
n : là khoảng thời gian của giai đoạn theo dừi (ngày).
- Số lỏ/cõy: Đếm trực tiếp số lỏ trờn thõn chớnh vào cỏc thời điểm khỏc nhau.
- Đường kớnh thõn (cm): Được đo ở khoảng giữa cỏc thõn chớnh.
- Độ phủ luống ( %): Đo trực tiếp độ phủ của từng cõy.
Cỏc chỉ tiờu sinh trưởng theo dừi ở cỏc thời điểm: 30, 45, 60 ngày sau trồng và khi thu hoạch.
* Cỏc yếu tố cấu thành năng suất:
- Số củ/ khúm, khối lượng trung bỡnh 1 khúm (gam), khối lượng trung bỡnh 1 củ (gam)
- Tỉ lệ củ thương phẩm (%): Củ cú khối lượng >25(gam)
- Phõn loại cỡ củ sau thu hoạch (%): Khi thu hoạch tiến hành dựng thước kẹp đo chiều ngang nơi rộng nhất của củ rồi phõn loại theo kớch thước đường kớnh ( >5(cm); 4- 5(cm); 3- 4(cm); 2- 3(cm); <2(cm)).
* Cỏc chỉ tiờu về chất lượng củ đỏnh giỏ theo cảm quan thụng qua quan sỏt: Màu vỏ củ, hỡnh dạng củ, độ sõu mắt củ, màu ruột củ.
2.2.3. Phƣơng phỏp hoỏ sinh
2.2.3.1. Xỏc định hàm lƣợng tinh bột
Xỏc định hàm lượng tinh bột theo phương phỏp Bertrand được mụ tả trong tài liệu của Phạm Thị Trõn Chõu và Cs [2].
Nguyờn tắc: Dưới tỏc dụng của axit, thuỷ phõn hoàn toàn tinh bột thành glucose. Định lượng đường khử xỏc định được hàm lượng tinh bột cú trong nguyờn liệu.
Khoai tõy gọt vỏ, cõn khối lượng, nghiền kỹ trong nước cất, thờm 5ml HCl đậm đặc, đun cỏch thuỷ trong 4giờ. Để nguội sau đú trung hoà mẫu và khử tạp. Định mức bằng nước cất và lọc hoặc li tõm để loại cặn. Dịch thu được sử dụng làm thớ nghiệm.
Đo glucose: Cho 20ml dung dịch Feling + 10ml dung dịch chiết + 20 ml dung dịch nước cất, đun sụi trong 3 phỳt đến xuất hiện kết tủa đỏ gạch Cu2O.
Để nguội, rửa kết tủa Cu2O ba lần bằng nước cất núng. Hoà tan kết tủa bằng
Fe2(SO4)3. Chuẩn độ dung dịch trong bỡnh (Fe++) bằng KMnO4 0,1N.
Hàm lượng glucose được tớnh theo cụng thức:
% 100 (%) a v G V X Trong đú: V: Thể tớch dịch dịch chiết.
G: Số gam glucose tương ứng với số ml KMnO40,1N (Tra bảng)
a: Số gam mẫu đem phõn tớch
Hàm lượng tinh bột được tớnh theo cụng thức: 9 , 0 (%) (%)X T Trong đú: T: Hàm lượng tinh bột X: Hàm lượng glucose
0,9: Hệ số quy đổi từ glucose thành tinh bột.
2.2.3.2. Xỏc định hàm lƣợng đƣờng tan
Xỏc định hàm lượng đường tan theo phương phỏp vi phõn tớch được mụ tả theo tài liệu của Phạm Thị Trõn Chõu và Cs (1998)[2].
Nguyờn tắc: Trong mụi trường kiềm, đường khử ferixianua kali thành feroxianua kali với sự cú mặt của gelatin, feroxianua kết hợp với sắt sunphỏt tạo thành phức chất màu xanh bền.
Củ khoai tõy gọt vỏ, cõn khối lượng, nghiền nhỏ, chiết bằng nước cất, li tõm 12000 vũng/phỳt trong 30 phỳt ở 40C. Dịch thu được sử dụng làm thớ nghiệm. Hàm lượng đường tan đo ở bước súng 585 nm dựa trờn đồ thị đường (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
chuẩn glucose. Hàm lượng đường tan được tớnh theo cụng thức:
% 100 (%) m HSPL b a X Trong đú:
X: Hàm lượng đường tan (% khối lượng tươi)
a: Nồng độ thu đuợc khi đo trờn mỏy (mg/ml).
b: Số ml dịch chiết
HSPL: Hệ số pha loóng
m: Khối lượng mẫu (mg)
2.2.3.3. Xỏc định hàm lƣợng protein
Hàm lượng protein tan được xỏc định theo phương phỏp lowry được mụ tả theo tài liệu của Phạm Thị Trõn Chõu và Cs (1998) [2].
Nguyờn tắc: Dựa vào sự hỡnh thành phức chất đồng và protein (phản ứng biure). Chất này cú tỏc dụng với thuốc thử foling cho màu đặc trương, cường độ màu tỉ lệ với hàm lượng protein. Phức chất màu xanh da trời cú độ hấp thụ cực đại ở bước súng 750nm.
Củ khoai tõy gọt vỏ, cõn khối lượng, nghiền nhỏ trong dung dịch đệm photphat citrat pH=10. Lắc 20 phỳt, để trong tủ lạnh 40C trong
24giờ. Ly tõm 12000vũng/phỳt trong 20 phỳt, thu dịch (lặp 2 lần), định mức lờn 2ml. Lấy 0,25ml dịch + 0,25ml foling, định mức lờn 2,5ml.
Tiến hành lặp lại 3 lần. Đo hấp thụ quang phổ trờn mỏy UV- Visible ở bước súng 750nm.
Hàm lượng protein được tớnh theo cụng thức:
% 100 (%) m HSPL A X Trong đú:
X:Hàm lượng protein (% khối lượng tươi)
A:Nồng độ thu đuợc khi đo trờn mỏy (mg/ml).
HSPL: Hệ số pha loóng
m:Khối lượng mẫu (mg)
2.2.3.4. Xỏc định hàm lƣợng Vitamin B6
Hàm lượng vitamin B6 được xỏc định theo tài liệu của Trương Cụng Quyền [22].
Xõy dựng đường chuẩn vitamin B6 để tớnh tương quan giữa lượng vitamin B6 và NaOH 0,1N dựng chuẩn độ.
Khoai tõy gọt vỏ, cõn khối lượng, nghiền nhỏ, chiết bằng nước cất, li tõm lấy dịch làm thớ nghiệm. Hàm lượng vitamin B6 được xỏc định qua lượng NaOH 0,1N dựng để chuẩn độ mẫu.
m b c a X 100 Trong đú:
X: Hàm lượng vitamin B6 trong 100gam mẫu tươi (mg/100g khối lượng tươi).
a: Số ml NaOH 0,1N dựng chuẩn độ mẫu.
b: Lượng vitamin B6 ứng với 1ml NaOH 0,1N.
c: Số ml NaOH 0,1N dựng chuẩn khụng bạch (khụng chứa mẫu phõn tớch)
m: Khối lượng mẫu phõn tớch ( 10gam mẫu tươi) 100: 100 gam mẫu tươi
2.2.3.5. Xỏc định hàm lƣợng vitamin C (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hàm lượng vitamin C được xỏc định theo phương phỏp Bacutrava được mụ tả trong tài liệu của Bacutrava (1973) [1].
Mẫu gọt vỏ, cõn khối lượng, nghiền và định mức bằng HCl 2% lờn 100ml. Lọc dịch và sử dụng để chuẩn độ bằng 2,6 DI. Cụng thức tớnh hàm lượng vitamin C: v A V T b a X ( ) 100 Trong đú:
X: Hàm lượng vitamin C trong 100gam mẫu tươi (mg/100g mẫu)
a: Số ml 2,6 DI chuẩn độ mẫu
b:Số ml 2,6 DI chuẩn độ khụng bạch
T: Số mg sinh tố C tương đương 1ml dung dịch màu 2,6 DI
V: Tổng thể tớch dung dịch mẫu (ml)
v: Thể tớch dịch mẫu đem phõn tớch (ml)
b a T 0,088
Trong đú:
0,088: Số mg sinh tố C tương đương với 1ml dung dịch iot 0,001N trong chuẩn độ (KIO3 0,001N)
a:Số ml dung dịch KIO30,001N đó dựngchuẩn độ
b: Số ml dung dịch chất chỉ thị màu 2,6 DI
2.2.3.6. Xỏc định hàm lƣợng khoỏng
* Khoỏng tổng số
Mẫu gọt vỏ, cõn khối lượng, cho vào chộn sứ đó sấy khụ, đốt mẫu ở
3000C trong 1 giờ, hỳt ẩm mẫu và tiếp tục đốt ở 550- 6000C trong 8 giờ. Hỳt ẩm mẫu và cõn khối lượng.
Hàm lượng khoỏng tổng số được xỏc định theo cụng thức:
(%) 100 (%) B A X Trong đú:
X:Hàm lượng khoỏng (% khối lượng tươi)
A:Khối lượng mẫu sau đốt (mg).
B:Khối lượng mẫu trước khi đốt (mg).
* Kali tổng số: Được xỏc định trờn thiết bị quang phổ hấp thụ nguyờn tử AAS. Khoai tõy gọt vỏ, cõn khối lượng, nghiền nhỏ, thờm 10ml hỗn hợp 2 axit
(HNO3 + HClO4), cụng phỏ ở 1500C- 2000C đến khi dung dịch chứa mẫu trong, để nguội, định mức lờn 100 ml, lọc dịch bằng giấy lọc, dịch lọc thu được sử dụng làm thớ nghiệm. Hàm lượng kali được đo trờn mỏy quang phổ hấp thụ nguyờn tử AAS ở bước súng 366,5nm.
Hàm lượng kali được tớnh theo cụng thức: (%) 100 ) ( (%) m V B A X Trong đú:
X:Hàm lượng kali (% khối lượng tươi)
A:Nồng độ thu được của mẫu khi đo trờn mỏy (mg/ml).
B:Nồng độ của đối chứng (mg/ml) (Khụng chứa mẫu phõn tớch)
V:Tổng thể tớch dung dịch mẫu (ml) m : Khối lượng mẫu đem phõn tớch (mg).
Chƣơng 3 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
KẾT QUẢ NGHIấN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Hiệu quả tạo khoai tõy củ bi in vitro, đặc điểm sinh lớvà tớnh toỏn chi phớ sản xuất khoai tõy củ bi trong phũng thớ nghiệm
3.1.1. Ảnh hƣởng của mật độ chồi cấy đến hiệu quả tạo củ bi nuụi cấy in vitro
Trờn cơ sở mụi trường nhõn chồi và tạo củ tối thớch đó được nghiờn cứu [39], chỳng tụi tiến hành nghiờn cứu sự ảnh hưởng của mật độ chồi cấy đối với sự tạo củ khoai tõy để cú thể tỡm ra mật độ thớch hợp cho hiệu quả tạo củ cao nhất. Thớ nghiệm thực hiện trong bỡnh tam giỏc với thể tớch 250ml với 100ml mụi trường nhõn chồi. Theo dừi khả năng tạo củ sau 7 tuần, chỳng tụi thu được kết quả ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của mật độ chồi cấy đến khả năng tạo củ bi in vitro
(Sau 7 tuần) Số chồi /bỡnh Số củ/bỡnh Tỷ lệ củ cú kớch thước < 0,5 cm (%) Tỷ lệ củ cú kớch Thước > 0,5 cm (%)
Solara Diamant Solara Diamant Solara Diamant
8-9 25,880,11 25,250,25 17,620,33 16,430,05 82,380,33 83,570,05