6.1. Phân loại theo phƣơng pháp cổ điển
Phương pháp phân loại cổ điển dựa trên các đặc điểm về hình thái, sinh lí- sinh hóa.
Các đặc điểm hình thái như kích thước, hình dạng, mầu sắc của khuẩn lạc, hình dạng, kích cỡ của tế bào vi sinh vật; cách sắp xếp của tế bào (đơn, kép
hay dạng chùm, dạng chuỗi v.v. khả năng bắt mầu khi nhuộm Gram; các đặc điểm vi cấu trúc như có tiên mao, tiêm mao hay không?, số lượng của tiên mao, tiêm mao, cách thức di chuyển của tế bào; hình dạng và vị trí của các cơ quan trong tế bào v.v.
Các đặc điểm về sinh lý và trao đổi chất như nguồn năng lượng, nguồn cacbon và nitơ mà sinh vật sử dụng, kiểu dinh dưỡng, các sản phẩm lên men, giới hạn về nhiệt độ và nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng và phát triển; dải pH và pH tối thích cho sinh trưởng, các sản phẩm trao đổi thứ cấp v.v.
Khóa phân loại vi khuẩn của Bergey là ví dụ điển hình của phương pháp phân loại vi sinh vật theo phương pháp truyền thống, khóa phân loại này hiện vẫn đang được cập nhật và được nhiều nhà vi sinh vật sử dụng.
6.2 Phƣơng pháp phân loại bằng sinh học phân tử
Phân loại bằng sinh học phân tử là phương pháp mới nhưng có độ chuẩn xác cao. Phương pháp này có thể phát hiện mô tả và giải thích tính đa dạng sinh học ở mức phân tử và quan hệ giữa các loài và trong phạm vi loài [7].
Bảng 1.2. Phân tích các thành phần hóa học của tế bào theo hệ thống hóa học Thành phần tế bào Phương pháp phân tích Phạm vi phân loại DNA nhiễm sắc thể Thành phần bazơ(%G+C) Chi
Biến tính DNA:DNA Loài
Các phần DNA được cắt
bằng enzyme giới hạn Loài và dưới loài Đa hình chiều dài các đoạn giới
RNA riboxom
Trình tự nucleotid Loài, chi và trên chi Lai DNA: rRNA
Protein
Trình tự amino acid Loài, chi và trên chi
So sánh bằng phản ứng huyết
thanh Loài và chi
Các kiểu điện di
Điện di enzyme đa vị trí Các dòng trong loài Thành tế bào Cấu trúc peptidoglycan Loài và chi Polysaccharid Acid teichoic Màng Acid béo Loài và chi Lipid phân cực Acid mycolic Isoprenoid quinones
Ngày nay phương pháp phân loại vi khuẩn bằng phương pháp xác định và so sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA đang được áp dụng phổ biến. Việc nghiên cứu phân tử rRNA là phương pháp hữu hiệu nhất để xác định mối quan hệ, tiến hóa của các vi sinh vật, vì rRNA có mặt ở tất cả các loại vi sinh vật, có khả năng xác định, có tính bảo thủ cao, chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm vi sinh vật. Tuy nhiên, dựa vào sự khác nhau này, người ta có thể đánh giá được mối quan hệ phát sinh chủng loại và phân loại vi sinh vật. Trong ba gen mã hóa rRNA của vi khuẩn 5S rRNA, 16S rRNA và 23S rRNA thì gen 16S rRNA là phù hợp nhất cho việc nghiên cứu phân loại hiện nay.
Gen mã hóa 5S rRNA có kích thước khoảng 120 nucleotid do có kích thước nhỏ nên thông tin chứa đựng ít do đó khó phân biệt được chính xác sự khác nhau giữa chi, giữa loài và trong loài của vi sinh vật cũng như vị trí phân loại của chúng. Gen mã hóa 23S rRNA có kích thước khoảng 2900 bp quá lớn cho nên không thuận lợi cho tách dòng, xác định trình tự và phân loại vi khuẩn. Gen mã hóa 16S rRNA có kích thước khoảng 1500 nucleotid vừa đủ để phân loại chi tiết giữa các chủng vi sinh vật không gây khó khăn trong các bước xác định trình tự gen và được ưu tiên chọn lựa trong phân loại vi khuẩn. Cấu trúc của gen mã hóa 16S đã được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ và đã thiết kế rất nhiều các cặp mồi chung dùng cho nhiều nhóm vi khuẩn cũng như các cặp mồi đặc hiệu riêng cho các chi và loài. Đây là một thuận lợi lớn cho các nghiên cứu phân loại vi khuẩn và xạ khuẩn dựa trên gen mã hóa 16S rRNA [29].
PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP