Tham khảo môi trường ra rễ của 1 số loại cây như: Pơmu [3], thông đỏ [12], giá ty [27], keo lai [28], lim xanh [11], thông Caribe [13]…chúng tôi nhận thấy, khả năng ra rễ của các cây phần lớn chịu ảnh hưởng của IBA hoặc NAA với nồng độ thấp. Với cây dẻ Trùng Khánh, chúng tôi nghiên cứu môi trường tạo rễ của chúng bằng cách bổ sung NAA với các nồng độ: 0,05; 0,1; 0,2; 0,3 và 0,4mg/l vào môi trường WPM. Theo dõi sự ra rễ sau 4 tuần và 8 tuần, kết quả được trình bày trong bảng 3.10.
Kết quả bảng 3.10 cho thấy, trong tất cả các môi trường có bổ sung NAA, cây dẻ đều ra rễ với tỉ lệ khá cao (sau 8 tuần đạt 5,11 - 7,17 rễ/cây và chiều dài từ 5,65cm đến 7,15cm). Trong đó, môi trường bổ sung NAA 0,2mg/l có tỉ lệ ra rễ cao nhất (100%), số rễ/ cây và chiều dài rễ cũng lớn nhất (đạt 7,17 rễ/cây và chiều dài rễ trung bình là 7,15cm sau 8 tuần). Công thức không bổ sung NAA (đối chứng) sau 4 tuần không thấy ra rễ nhưng sau 8 tuần có 1 số cây ra rễ chiếm tỉ lệ thấp (5,56%) và rễ cũng ngắn nhất (chiều dài 1,28cm và đạt 1,67 rễ/cây sau 8 tuần).
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ dẻ
CT α – NAA Tỉ lệ tạo rễ (%) Số rễ/cây (rễ/cây) Kích thước rễ (cm) Sau 4 tuần ĐC 0,0 0,00 0,00 0,00 1 0,05 77,78±0,21 2,83±0,51 1,33±0,12 2 0,1 94,44±0,17 3,50±0,34 1,81±0,17 3 0,2 100,00±0,00 4,11±0,33 2,05±0,78 4 0,3 88,89±0,22 3,22±0,37 1,95±0,56 5 0,4 83,33±0,34 3,33±0,33 1,78±0,67 Sau 8 tuần ĐC 0,0 5,56±0,17 1,67±0,15 1,28±0,35 1 0,05 77,78±0,21 5,11±0,78 6,45±0,31 2 0,1 94,44±0,17 6,61±0,52 6,11±0,98 3 0,2 100,00±0,00 7,17±0,38 7,15±0,46 4 0,3 88,89±0,21 6,44±0,62 5,65±0,87 5 0,4 94,44±0,17 6,72±0,47 7,05±0,79
Như vậy, môi trường có bổ sung NAA ảnh hưởng tốt nhất đến sự tạo rễ của chồi dẻ trong ống nghiệm là môi trường có thành phần: WPM + đường sucrose 25g/l + agar 8,5g/l + nước dừa 200ml/l + NAA 0,2mg/l.
A B
Hình 3.9. Cây dẻ ra rễ (sau 8 tuần)
A: α - NAA 0,4mg/l B: α - NAA 0,2mg/l
3.2.4. Kết quả đƣa cây ra môi trƣờng tự nhiên
Với hầu hết các cây nuôi cấy mô, đưa cây con ra ngoài môi trường tự nhiên là công đoạn khó vì trong môi trường thí nghiệm, cây được chăm sóc tối ưu về cả điều kiện dinh dưỡng cũng như các chế độ về nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm. Cây trong điều kiện thí nghiệm cũng không bị nhiễm các loại nấm gây bệnh và không tiếp xúc với các loại sâu bệnh như bên ngoài môi trường tự nhiên. Sau khi nghiên cứu quy trình đưa cây con ra ngoài môi trường ở 1 số loại cây khác nhau, điều kiện đất đai ở vùng Trùng Khánh - Cao Bằng cũng như quy trình trồng cây dẻ của người dân ở đây, chúng tôi đã trồng thử nghiệm cây dẻ Trùng Khánh trên 3 loại giá thể khác nhau (đất, trấu hun và đất + trấu hun).
Trước tiên, mở nút bông của bình tam giác cho cây dẻ con quen dần với điều kiện tự nhiên trong 4 ngày. Sau đó, lấy cây dẻ con ra và rửa sạch thạch còn bám trên gốc và rễ cây. Trong 1 tuần đầu, tưới cho cây con bằng dung dịch WPM pha loãng 10 lần. Các tuần tiếp theo, cây dẻ con được tưới nước hàng ngày với lượng nước thấp và bón 1 lượng nhỏ phân tổng hợp NPK ở tuần thứ 4 sau khi trồng trong chậu để đảm bảo dinh dưỡng cho cây. Theo
dõi tỉ lệ sống và chiều cao cây trong 8 tuần. Kết quả được trình bày trong bảng 3.11.
Kết quả đưa cây dẻ môi trường khá tốt với tỉ lệ cây sống đạt từ 72,09% đến 86,05%. Cây dẻ con có khả năng sống tốt nhất trên giá thể đất + trấu hun (86,05% cây sống). Theo dõi chiều cao cây ở các thời gian khác nhau, chúng tôi nhận thấy, trong 4 tuần đầu, do cây chưa quen với điều kiện môi trường ngoài nên tăng chiều cao chưa nhiều (tăng từ 3,07cm đến 3,34cm trong 4 tuần đầu). Nhưng sau đó cây thích ứng dần với điều kiện sống mới và tăng chiều cao mạnh hơn (tăng từ 4,03cm đến 5,05cm trong 4 tuần tiếp theo). Chiều cao ở cả 4 tuần đầu và 4 tuần kế tiếp đều tăng nhanh nhất ở giá thể đất + trấu hun (trung bình 4 tuần đầu tăng 3,34 cm, 4 tuần sau tăng 5,05cm). Khi quan sát hình thái cây, chúng tôi cũng thấy ở giá thể đất + trấu hun, cây mập và lá phát triển tốt hơn ở 2 giá thể còn lại.
Bảng 3.11. Kết quả đưa cây ra môi trường tự nhiên
Giá thể Số cây đem trồng Số cây sống (sau 8 tuần) Tỉ lệ sống (%) (Sau 8 tuần)
Chiều cao cây (cm) Cây mới trồng Sau 4 tuần Sau 8 tuần Đất 43 31 72,09±0,23 5,48±0,11 8,55±0,10 13,52±0,13 Trấu hun 43 34 79,07±0,15 5,35±0,18 8,44±0,17 12,47±0,21 Đất + trấu hun 43 37 86,05±0,21 5,45±0,17 8,79±0,13 13,84±0,27
Như vậy, giá thể đất + trấu hun là giá thể thích hợp nhất để đưa cây dẻ con trong phòng thí nghiệm ra trồng ngoài môi trường tự nhiên.
1A 1B 1C 2A 2B 2C 3A 3B 3C
Hình 3.10: Cây dẻ con trồng ngoài môi trường tự nhiên với các giá thể khác nhau
1: Cây dẻ con mới trồng 2: Cây dẻ trồng ngoài môi trường sau 4 tuần 3: Cây dẻ trồng ngoài môi trường tự nhiên sau 8 tuần
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận
1. Phân tích mối quan hệ di truyền giữa 5 mẫu dẻ bằng kỹ thuật RAPD, kết quả thu được như sau:
1.1. Phân tích RAPD với DNA của 5 mẫu dẻ với 10 mồi ngẫu nhiên thì có 5/10 mồi cho tính đa hình.
1.2. Các mẫu dẻ lấy từ các khu vực khác nhau của huyện Trùng Khánh - Cao Bằng và mẫu dẻ từ Vân Nam - Trung Quốc có hệ số tương đồng di truyền đạt 100%. Mẫu dẻ Bắc Giang có sự tương đồng di truyền với các mẫu dẻ nghiên cứu là 69,6%.
1.3. Các mẫu dẻ TK1, TK2, TK3 và TQ thuộc cùng một loài Castanea molissima Blum (dẻ Trùng Khánh, dẻ Cao Bằng, dẻ Pố Tấu) thuộc chi
CASTANEA Mill.1754 (Dẻ Trùng Khánh). Mẫu dẻ Bắc Giang, có sự sai khác so với 4 mẫu còn lại tới 30,4% (1- 0,696). Mẫu này thuộc loài
Castanopsis boisii Hickel & Camus, 1992 (dẻ gai Yên Thế, dẻ gai Bắc Giang) trong chi CASTANOPSIS.
2. Quy trình nhân giống dẻ Trùng Khánh - Cao Bằng bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro:
2.1. Công thức tốt nhất cho sự khử trùng hạt dẻ Trùng Khánh là: Cồn 70o trong 7 phút, khử trùng tiếp bằng javen 65% trong 25 phút, tráng bằng nước cất vô trùng.
2.2. Môi trường kết hợp BAP 0,5mg/l + NAA 0,2mg/l cho khả năng tạo đa chồi cao nhất đạt 5,5 chồi/mô và chiều cao trung bình của các chồi là 4,19cm sau 6 tuần.
2.3. Môi trường có thành phần: WPM + agar 8,5g/l + đường sucrose 25g/l + nước dừa 200ml/l + NAA 0,2mg/l có ảnh hưởng tôt nhất đến sự ra rễ của
chồi dẻ trong ống nghiệm, chồi ra rễ đạt 100%, trung bình là 7,17 rễ/chồi, chiều dài rễ đạt 7,15cm.
2.4. Giá thể tốt nhất để đưa cây dẻ Trùng Khánh ra môi trường tự nhiên là đất + trấu hun với tỉ lệ sống đạt 86,05% và chiều cao sau 8 tuần trung bình là 13,84 cm, cao hơn cây mới trồng đem trồng là 253,94%.
Đề nghị
Do hạn chế về thời gian, chúng tôi nghiên cứu mối quan hệ di truyền của một số mẫu dẻ bằng kỹ thuật RAPD với 10 mồi ngẫu nhiên. Để có kết luận chính xác hơn, cần tiến hành nghiên cứu với nhiều mồi hơn nữa và sử dụng kết hợp với các phương pháp khác nhau.
CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ
1. Nguyễn Minh Quế, Nguyễn Thị Tâm (2009), “Đánh giá mối quan hệ di truyền của một số giống dẻ bằng kĩ thuật RAPD”, Tạp chí Kinh tế và Sinh thái, số 30/2009, tr 15 - 22.
2. Nguyễn Thị Tâm, Nguyễn Minh Quế (2009), “Nghiên cứu quy trình bảo tồn nguồn gen cây dẻ Trùng Khánh - Cao Bằng bằng kỹ thuật In vitro”, Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
[1]. Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Quang Thạch, Từ Thị Hoài Thu (1999), "Nghiên cứu phương thức nhân nhanh một số giống hoa cúc chùm Hà Lan", Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nxb KH&KT Hà Nội, tr.735 - 739.
[2]. Nguyễn Thế Anh, Trần Văn Minh (2007), “Vi nhân giống cây pơmu (Forkienia hodginsii (Dunn) A. Henry & H. H Thomas)”, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nxb KH&KT Hà Nội, tr.647 - 649.
[3]. Nguyễn Tiến Bân (2003), Danh mục các loài thực vật Việt Nam, Nxb Nông nghiệp Hà Nội, Tập II, tr.227 - 269.
[4]. Nguyễn Tiến Bân (2004), “Cơ sở phân loại họ dẻ - Fagaceae Durmort ở Việt Nam”, Tạp chí Sinh học, Tập 26 (4A), tr.2 - 10.
[5]. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thi Muội (1997), Công nghệ sinh học trong cải tiến giống cây trồng, Nxb Nông nghiệp Hà Nội.
[6]. Ngô Xuân Bình, Bùi Bảo Hoàn, Nguyễn Thuý Hà (2003),
Giáo trình Công nghệ sinh học, Nxb Nông nghiệp Hà Nội.
[7]. Nguyễn Việt Cƣờng, Phạm Đức Tuấn (2007), “Ứng dụng chỉ thị phân tử (RAPD và DNA lục lạp) trong nghiên cứu đa dạng di truyền và xây dựng vườn giống cây cóc hành”, Tạp chí NN & PTNT, số 19, tr.69 - 75.
[8]. Võ Văn Chi, Dƣơng Đức Tiến (1978), Phân loại thực vật, thực vật bậc cao, NXB Đại học và Trung học chuyên nghiệp Hà Nội.
[9]. Nguyễn Thị Dung, Nguyễn Văn Thiết, Nguyễn Hoàng Tỉnh
(2005), “Sử dụng kỹ thuật RAPD và AFLP để nghiên cứu quan hệ di truyền của 2 giống vải thiều và vải chua”, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nxb KH&KT Hà Nội, tr.1160 - 1162.
[10]. Trần Văn Định, Trần Văn Minh (2007), “Nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong bảo tồn và phát triển nguồn gen cây thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.)”, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nxb KH & KT Hà Nội, tr.679 - 681.
[11]. Trịnh Nguyên Đức, Trần Văn Minh (2007), “Vi nhân giống cây lim xanh (Erythrophloeum fordii Oliv.)”, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nxb KH&KT Hà Nội, tr.689 - 691.
[12]. Nguyễn Nhƣ Hiền, Nguyễn Nhƣ Ất (2001), Công nghệ sinh học và ứng dụng vào nông nghệp phát triển nông thôn, Nxb Thanh niên.
[13]. Trần Trung Hiếu, Nguyễn Xuân Thƣơng, Kiều Phƣơng Nam, Bùi Văn Lệ (2003), “Bước đầu nhân nhanh giống thông Caribe (Pinus caribeae) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro”, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nxb KH&KT Hà Nội , tr.880 - 884.
[14]. Ngô Xuân Hoàng (2008), “Thực trạng và giải pháp chủ yếu nhằm phát triển sản xuất hạt dẻ ở tỉnh Cao Bằng”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ - Đại học Thái Nguyên, số 3 (47), Tập 1, tr.40 - 45.
[15]. Nguyễn Hữu Hổ, Phan Tƣờng Lộc, Lê Tấn Đức, Phạm Đức
Trí, Nguyễn Thị Thanh (2007), “Tái sinh in vitro cây cúc (Dadrenthema morifolium L.)”, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nxb KH&KT Hà Nội, tr.715 - 718.
[16]. Nguyễn Ngọc Huệ, Trần Danh Sửu, Trịnh Hồng Kiên
(2005), “Đánh giá đa dạng nguồn gen xoài Việt Nam (Mangifera)”, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nxb KH&KT Hà Nội, tr.1250 - 1253.
[17]. Dƣơng Công Kiên (2003), Nuôi cấy mô thực vật, Nxb Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh.
[18]. Đinh Đoàn Long, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh, Hà Thị Thuý, Bernd Bueter (2004), “Nhân giống vô tính in vitro các dòng Kava (Pipe methusticum G. Forster) có hoạt tính sinh học cao”, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong Khoa học sự sống, Nxb KH&KT Hà Nội, tr.536 - 50.
[19]. Đoàn Thị Mai, Lê Sơn, Lƣơng Minh Hoan, Lê Trần Bình,
Đinh Thị Phòng, Lê Thị Muội (2003), “Nhân giống một số loài cây trồng có năng suất, chất lượng cao bằng phương pháp nuôi cấy mô”, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nxb KH & KT Hà Nội, tr.910 - 914.
[20]. Chu Văn Mẫn (2000), Ứng dụng tin học trong sinh học, Nxb Đại học Quốc Gia Hà Nội.
[21]. Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Hoa Lan (2005), “Đa dạng di truyền một số giống lạc trồng (Archis hypogaea L.)”, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nxb KH&KT Hà Nội, tr.1304 - 1307.
[22]. Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Ngọc Lan, Nguyễn Vũ
Thanh Thanh, Nguyễn Thị Vân Anh (2007), “Sự đa dạng về kiểu gen và kiểu hình chịu hạn của một số giống lúa cạn địa phương miền núi”, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nxb KH & KT, tr.759 - 762.
[23]. Khƣu Hoàng Minh, Trần Văn Minh (2007), “Vi nhân giống cây trai Nam Bộ (Fagarea cochinchinensis A. chev)”, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nxb KH&KT Hà Nội, tr.763 - 765.
[24]. Trần Văn Minh (1997), Công nghệ tế bào thực vật, Nxb Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.
[25]. Trần Văn Minh, Bùi Thị Tƣờng Thu (2003), “Ứng dụng công nghệ tế bào thực vật nhân nhanh loài gỗ quý giá ty (Tectona Grandis
Linn. F)”, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nxb KH & KT Hà Nội, tr.352 - 357.
[26]. Trần Văn Minh, Lê Hữu Thƣơng (2007), “Ứng dụng công nghệ phôi soma trong dòng hoá cây keo lai (Acacia sp.)in vitro”, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nxb KH&KT Hà Nội, tr.766 - 768.
[27]. Hoàng Thị Sản (2003), Phân loại học thực vật, Nxb Giáo dục. [28]. Nguyễn Thị Thanh, Võ Phan Misa (2007), “Nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro và ứng dụng cho chuyển gen ở cây hồ tiêu (Piper nigrum L.)”, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nxb KH&KT, tr.820 - 823.
[29]. Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật - nghiên cứu và ứng dụng, Nxb Nông nghiệp Hà Nội.
[30]. Nguyễn Đức Thành, Phạm Duy Toản, Nguyễn Hoàng Anh
(2000), “Ứng dụng chỉ thị phân tử RAPD và STS trong nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn giống ở lúa”, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong sinh học, Nxb Đại học quốc gia Hà Nội, tr.149 - 152.
[31]. Bùi Văn Thắng, Hà Văn Huân, Nguyễn Văn Việt, Hồ Văn
Giảng (2007), “Xây dựng hệ thống tái sinh cây xoan ta (Melia azedarach
L.) phục vụ cho chuyển gen”, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nxb KH&KT, tr.815 - 819.
[32]. Nguyễn Văn Thiết, Lê Thị Lan Oanh (2001), “Nghiên cứu đa dạng sinh học của nhãn trồng ở Việt Nam bằng kỹ thuật RAPD”, Tạp chí
Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Số 7, tr.444 - 446.
[33]. Lò Thị Mai Thu, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Ngọc Lan,
di truyền một số giống lúa cạn có khả năng chịu hạn khác nhau”, Tạp chí Khoa học & Công nghệ - Đại học Thái Nguyên, Số 3(47), tr.57 - 62.
[34]. Nguyễn Xuân Thụ, Lê Thị Lan Oanh, Nguyễn Thị Dung
(1998), “Sử dụng dấu chuẩn RAPD để nhận dạng 1 số giống chuối trồng ở Việt Nam”, Tạp chí di truyền và ứng dụng, Số 3, tr.20 - 25.
[35]. Đỗ Năng Vịnh (2002), Công nghệ sinh học cây trồng, Nxb Nông nghiệp Hà Nội.
[36]. Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn (1998), Sinh lý học thực vật, Nxb Giáo dục.
[37]. Nguyễn Thị Kim Uyên, Trần Văn Minh (2007), “Dòng hoá
cây thanh hao (Artemisia annua L.) in vitro”, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nxb KH&KT Hà Nội, tr.872 - 875.
[38]. http://www.caobang.gov.vn
[39].http://vi.Wikipedia.org/wiki/K%E1%BB%B9_thu%E1%BA% ADt_RAPD
Tiếng Anh
[40]. Doyle J.J. and Doyle J.L. (1990), "Isolation of Plant DNA from fresh tissue", Focus, 12, p.13 - 15.
[41]. Nei M and Li WH (1979), "Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction end nucleases", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, p.5269 - 5273.
[42]. O. L. Gamborg G. C. Phillips Eds, Plant cell tissue and organ culture, Fundamental Methods.
PHỤ LỤC
Hình 1. Cây dẻ Trùng Khánh - Cao Bằng
Xác nhận của giáo viên hướng dẫn